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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pYES2 载体构建表达方向的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】pYES2 载体构建表达方向的问题

最近在做将质粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后将G418 基因扩增后连接进行质粒改造， 问题是在设计引物时扩增G418基因上游引物带有NdeI酶切位点，下游带有NheI 酶切位点，如图所示以GAL1启动子为1， 酶切位点NdeI(3700,如图在NheI的右侧)，NheI (3840)，请问各位虫友这样连接的话是不是外源的G418基因连接方向是反向的，我是否需要重新合成引物调换酶切位点？ 谢谢帮忙！


[ Last edited by xtcao668 on 2011-4-13 at 09:02 ]
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1楼2011-04-12 23:44:19
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
xtcao668(金币+1): 谢谢交流 2011-04-26 15:21:45
引用回帖:
Originally posted by xtcao668 at 2011-04-12 23:44:19:
最近在做将质粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后将G418 基因扩增后连接进行质粒改造， 问题是在设计引物时扩增G418基因上游引物带有NdeI酶切位点，下游带有NheI 酶切位点，如图所示以GAL1启动子为1， 酶切位 ...

NdeI(3700)在图上没看到呢 还是我眼浊了？
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2楼2011-04-13 00:08:11
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
在NheI的右侧，谢谢！图上忘了标注！
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3楼2011-04-13 09:03:52
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
xtcao668(金币+2): 谢谢帮忙！ 2011-04-13 09:45:45
西瓜(金币+3): good 2011-04-13 10:33:35
xtcao668(金币+1): 谢谢！ 2011-04-26 15:22:13
引用回帖:
Originally posted by xtcao668 at 2011-04-13 09:03:52:
在NheI的右侧，谢谢！图上忘了标注！

你扩增G418基因的时候，是应该连带G418基因前面的启动子一起扩增的，是整个表达元件的扩增（仅扩增基因没办法表达哦），竟然是整个表达元件插入到载体，作为一个整体的表达单元在载体上正插入和反插入都能表达的。
PS：你也看到了，质粒图谱箭头都有逆时针方向和顺时针方向同时存在的。
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4楼2011-04-13 09:35:55
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haiyanli111

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by susizheng at 2011-04-13 09:35:55
你扩增G418基因的时候，是应该连带G418基因前面的启动子一起扩增的，是整个表达元件的扩增（仅扩增基因没办法表达哦），竟然是整个表达元件插入到载体，作为一个整体的表达单元在载体上正插入和反插入都能表达的 ...

你好！我也遇到了前面那位的问题，你说的表达元件是什么意思，我构建的时候直接在起始密码子和终止密码子前后加的酶切位点，这样是一个基因吧！谢谢指教！
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5楼2013-06-17 09:30:00
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cxtcjf

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by haiyanli111 at 2013-06-17 09:30:00
你好！我也遇到了前面那位的问题，你说的表达元件是什么意思，我构建的时候直接在起始密码子和终止密码子前后加的酶切位点，这样是一个基因吧！谢谢指教！...

基因的启动子、ORF和终止子啊
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6楼2013-06-17 21:50:34
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by haiyanli111 at 2013-06-17 09:30:00
你好！我也遇到了前面那位的问题，你说的表达元件是什么意思，我构建的时候直接在起始密码子和终止密码子前后加的酶切位点，这样是一个基因吧！谢谢指教！...

太复杂了，直接把两个LOXP一起弄进去就得了
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7楼2014-06-23 10:20:33
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主构建成功了吗？我现在也在这样构建！但没有成功，不知道楼主能否馈赠该质粒呢！谢谢
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8楼2014-08-12 11:14:19
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by jiaoxiayoulu at 2014-08-12 11:14:19
请问楼主构建成功了吗？我现在也在这样构建！但没有成功，不知道楼主能否馈赠该质粒呢！谢谢

亲，请问 您有pYES2质粒吗？能否赠送一些？
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9楼2015-05-18 15:13:50
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