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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体后不表达
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wendaojue

铜虫 (著名写手)

[求助] 构建载体后不表达

做了好久，总算把载体构建好了，测序都没问题，但是就是不表达，很郁闷。想请教下，有什么原因会引起不表达吗？
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1楼2011-07-15 16:44:48
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 对的 2011-07-15 18:54:42
说的太笼统，希望详细点才好给人回答。
不知道你的是原核表达还是真核，有没有验证转化子，启动子是不是和宿主匹配、宿主会不会降解产物等等。
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2楼2011-07-15 16:50:15
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励 2011-07-15 18:54:51
有没有分析稀有密码子存在情况，还有读码框是否正确？很多原因都能引起不表达的。
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3楼2011-07-15 17:04:47
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wendaojue

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by anlewo7777 at 2011-07-15 16:50:15:
说的太笼统，希望详细点才好给人回答。
不知道你的是原核表达还是真核，有没有验证转化子，启动子是不是和宿主匹配、宿主会不会降解产物等等。

不好意思，我也是刚开始做克隆，是在真核中表达，启动子是CMV。如何验证转化子呢？我酶切和测序都是对的。
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4楼2011-07-16 13:53:38
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ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 专业，辛苦 2011-07-18 12:48:15
wendaojue(金币+2): 2011-08-02 10:02:27
楼主所说的目的蛋白不表达是如何鉴定的？
检测一个蛋白是否表达包括，转化子的鉴定，mRNA水平的检测，蛋白水平的检测包括液相色谱检测，抗体检测，质谱检测，蛋白活性检测。不知道楼主是从哪个水平上得出的目的蛋白没有表达这个结论。
蛋白不能正常表达原因很多，在真核表达中常出现的问题有，密码子偏好性问题（这直接决定你的蛋白是否会顺利正确的翻译出来），mRNA稳定性问题（宿主自身的防御机制是否会降解mRNA），还有你的蛋白稳定性问题（蛋白表达过程中，温度PH等条件的影响）。从宿主方面来讲，你的目的蛋白对宿主的毒性问题，你的宿主是否会产生能降解目的蛋白的酶，还有就是一个宿主表达蛋白的分子量是有上限和下限的，所以你的蛋白的大小是否适合于你的宿主来表达。另外，还有蛋白的折叠问题等等。
楼主说做了酶切和测序都是正确的，这只能说明你的质粒构建是正确的。而转入宿主之后，质粒是与宿主基因组整合还是独立的？是单拷贝还是多拷贝？以及如何进行的筛选?这些环节都会直接影响目的蛋白的表达。我曾经做过毕赤酵母表达系统，由于我的目的蛋白很小，表达量很低，又没有对应的抗体，表达初期只能靠抑菌活性来检测，结果一直检测不到活性，后来打了质谱发现目的蛋白已经表达了，只是表达量太低。后来从高产菌株筛选入手，结果得到了比较理想的效果。
楼主提到CMV启动子，貌似是在细胞内表达的吧，由于本人没有亲自做过细胞表达，所以以上为一点浅薄的经验，希望能对您有帮助。
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平生我自知
5楼2011-07-16 20:13:21
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by ybs007 at 2011-07-16 20:13:21:
楼主所说的目的蛋白不表达是如何鉴定的？
检测一个蛋白是否表达包括，转化子的鉴定，mRNA水平的检测，蛋白水平的检测包括液相色谱检测，抗体检测，质谱检测，蛋白活性检测。不知道楼主是从哪个水平上得出的目的蛋 ...

此位虫友说的很有道理 的确表达不容易 需要慢慢来做
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
6楼2011-07-18 00:41:04
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