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wendaojue铜虫 (著名写手)
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[求助]
构建载体后不表达
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| 做了好久，总算把载体构建好了，测序都没问题，但是就是不表达，很郁闷。想请教下，有什么原因会引起不表达吗？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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wendaojue
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4楼2011-07-16 13:53:38
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3楼2011-07-15 17:04:47
【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, EPI+1): 专业，辛苦 2011-07-18 12:48:15
wendaojue(金币+2): 2011-08-02 10:02:27
dhd997(金币+5, EPI+1): 专业，辛苦 2011-07-18 12:48:15
wendaojue(金币+2): 2011-08-02 10:02:27
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楼主所说的目的蛋白不表达是如何鉴定的？ 检测一个蛋白是否表达包括，转化子的鉴定，mRNA水平的检测，蛋白水平的检测包括液相色谱检测，抗体检测，质谱检测，蛋白活性检测。不知道楼主是从哪个水平上得出的目的蛋白没有表达这个结论。 蛋白不能正常表达原因很多，在真核表达中常出现的问题有，密码子偏好性问题（这直接决定你的蛋白是否会顺利正确的翻译出来），mRNA稳定性问题（宿主自身的防御机制是否会降解mRNA），还有你的蛋白稳定性问题（蛋白表达过程中，温度PH等条件的影响）。从宿主方面来讲，你的目的蛋白对宿主的毒性问题，你的宿主是否会产生能降解目的蛋白的酶，还有就是一个宿主表达蛋白的分子量是有上限和下限的，所以你的蛋白的大小是否适合于你的宿主来表达。另外，还有蛋白的折叠问题等等。 楼主说做了酶切和测序都是正确的，这只能说明你的质粒构建是正确的。而转入宿主之后，质粒是与宿主基因组整合还是独立的？是单拷贝还是多拷贝？以及如何进行的筛选?这些环节都会直接影响目的蛋白的表达。我曾经做过毕赤酵母表达系统，由于我的目的蛋白很小，表达量很低，又没有对应的抗体，表达初期只能靠抑菌活性来检测，结果一直检测不到活性，后来打了质谱发现目的蛋白已经表达了，只是表达量太低。后来从高产菌株筛选入手，结果得到了比较理想的效果。 楼主提到CMV启动子，貌似是在细胞内表达的吧，由于本人没有亲自做过细胞表达，所以以上为一点浅薄的经验，希望能对您有帮助。 |
5楼2011-07-16 20:13:21
