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hyacinth326金虫 (正式写手)
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[求助]
请教大家一个有关载体构建的问题，金币多多~~
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各位兄弟姐们大家好，我想请教一个关于载体构建的问题，因为这个载体已经构建了半年了，一直不成功，我们导师私底下说，如果我再构建不成功的话，就只能说明我能力有问题了，所以大家一定多帮帮我，我不想被别人说成是能力问题。 首先介绍一下基本情况吧：我想构建一个载体，包含两个片段，片段一：还有一个质粒的温度敏感复制区和复制蛋白，在这个片段的选择上我认为是应该没有问题的，因为我是通过要用做模板的这个质粒与构建这个质粒的原始质粒进行比对选取的，将pcr出来的目的片段连接到克隆载体上。片段二：是一个质粒的多克隆位点，抗生素序列还有蔗糖致死基因，这个片段pcr获得之后就连到克隆载体上了，并且抗生素抗性和蔗糖致死功能都验证了没有问题。然后我将这两个连接到克隆载体上的片段切下来，连接转化大肠杆菌感受态，结果试了很多次都没有阳性转化子。 我用的限制性内切酶是NcoI和XhoI，实在找不出原因了，麻烦大家帮忙分析一下可能存在的原因吧，如果能解决问题，小女子甘愿奉上所有金币，只为争一口气。 |
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【答案】应助回帖
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不好意思，的确实我看错， 你的这个两个片段分别多大哈 质粒的温度敏感复制区和复制蛋白 多克隆位点，抗生素序列还有蔗糖致死基因 没有阳性转化子有没有可能跟你的培养条件有关，比如温度，因为你这是温度敏感，营养，因为你这是蔗糖致死，所以你有没有必要check一下这个 |
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hyacinth32610楼2013-04-02 20:51:17
