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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教大家一个有关载体构建的问题，金币多多~~
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

[求助] 请教大家一个有关载体构建的问题，金币多多~~

各位兄弟姐们大家好，我想请教一个关于载体构建的问题，因为这个载体已经构建了半年了，一直不成功，我们导师私底下说，如果我再构建不成功的话，就只能说明我能力有问题了，所以大家一定多帮帮我，我不想被别人说成是能力问题。
首先介绍一下基本情况吧：我想构建一个载体，包含两个片段，片段一：还有一个质粒的温度敏感复制区和复制蛋白，在这个片段的选择上我认为是应该没有问题的，因为我是通过要用做模板的这个质粒与构建这个质粒的原始质粒进行比对选取的，将pcr出来的目的片段连接到克隆载体上。片段二：是一个质粒的多克隆位点，抗生素序列还有蔗糖致死基因，这个片段pcr获得之后就连到克隆载体上了，并且抗生素抗性和蔗糖致死功能都验证了没有问题。然后我将这两个连接到克隆载体上的片段切下来，连接转化大肠杆菌感受态，结果试了很多次都没有阳性转化子。
我用的限制性内切酶是NcoI和XhoI，实在找不出原因了，麻烦大家帮忙分析一下可能存在的原因吧，如果能解决问题，小女子甘愿奉上所有金币，只为争一口气。
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1楼 2013-03-31 16:03:57
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 10:22:32
我做过overlap，不过是构建别的，但是我这个一个片段5000多，一个靠近2000，overlap的难度挺大的吧，而且我是想让这两个片段成为一个环状的质粒。...

如果你用Overlap做的话，真的非常容易，根据上面的描述，你分别PCR到两个片段，然后连入载体，再分别切下来，三片段连入目标载体，三片段连不是不可以，但是效率要低很多。

假若按你的方法，你说结果试了很多次都没有阳性转化子。这个没有阳性转化子是什么意思，是平板上不长菌落，还是长的菌落是假的。
如果是假的，你有分析原因吗，是因为载体没有被双酶切开吗？如果载体被酶切的很干净的话，三片段连也是很好连的。

既然你的老板催的比较紧，你不妨overlap一试，就是花的合成引物的钱嘛。
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8楼2013-04-02 19:55:44
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jk_xdx

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先回答问题：
两个片段之间是用什么方法连的？
是先将片段连接了再插入载体还是三段同时连接？
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2楼2013-03-31 22:50:22
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jk_xdx

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hyacinth326: 金币+5, ★★★很有帮助, 多谢关注 2013-04-01 12:23:43
首先，确认抗生素基因片段是否完整（有的时候，特别是有两种抗性的，其中1种可能并不完整），以及是否有可能用错，
第2，设对照，证明感受态没问题
第3，确认致死基因没有表达（如果确认理论上没有表达，那么考虑培养基的组分是否可能含有极少量的诱导物，不行就借别人的平板试试），
第4，建议先用overlap PCR 将两个片段 连接，回收目的长度的片段后再连接载体，每一步都要有确切的电泳照片，大小一定要对才行！
先试试看，再说。
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3楼2013-03-31 23:04:05
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-03-31 23:04:05
首先，确认抗生素基因片段是否完整（有的时候，特别是有两种抗性的，其中1种可能并不完整），以及是否有可能用错，
第2，设对照，证明感受态没问题
第3，确认致死基因没有表达（如果确认理论上没有表达，那么考虑 ...

多谢你的关注
抗生素是没有问题的，因为我将含有抗生素的片段连接到载体上之后验证了抗生素的功能。
感受态是没有问题的，我自己做的，而且验证了之后再做的实验。
蔗糖致死基因在没有蔗糖存在的条件下，是不致死的，我的平板就是LB+抗生素，所以这个应该也没有问题。
第四个问题我不太懂，我是想把两个片段连接成一个载体，这两个片段我已经连接到克隆载体上了，为什么还得overlap呢？
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4楼2013-04-01 12:22:54
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-03-31 22:50:22
首先回答问题：
两个片段之间是用什么方法连的？
是先将片段连接了再插入载体还是三段同时连接？

这两个片段是通过酶切连接转化的方法连接的，因为这两个片段其中有一个片段是一个质粒的复制区域。我是想直接将这两个片段连成一个载体。
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5楼2013-04-01 12:28:39
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jk_xdx

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

overlap PCR 是用PCR 方法将两个片段连接成一个片断,
优点是可以明确已经将两者连接成一个片断,比酶切连接更可靠,不容易出错,
缺点是需要使用high fidelity 的PCR polymerase, 操作结束后需要测序.
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6楼2013-04-02 10:12:58
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-04-02 10:12:58
overlap PCR 是用PCR 方法将两个片段连接成一个片断,
优点是可以明确已经将两者连接成一个片断,比酶切连接更可靠,不容易出错,
缺点是需要使用high fidelity 的PCR polymerase, 操作结束后需要测序.

我做过overlap，不过是构建别的，但是我这个一个片段5000多，一个靠近2000，overlap的难度挺大的吧，而且我是想让这两个片段成为一个环状的质粒。
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7楼2013-04-02 10:22:32
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 19:55:44
如果你用Overlap做的话，真的非常容易，根据上面的描述，你分别PCR到两个片段，然后连入载体，再分别切下来，三片段连入目标载体，三片段连不是不可以，但是效率要低很多。

假若按你的方法，你说结果试了很多次 ...

不好意思，可能你没有看明白，我只是需要将两个片段练成一个载体，并不是需要将两个片段连到一个载体上。
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9楼2013-04-02 20:07:32
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 20:07:32
不好意思，可能你没有看明白，我只是需要将两个片段练成一个载体，并不是需要将两个片段连到一个载体上。...

不好意思，的确实我看错，
你的这个两个片段分别多大哈
质粒的温度敏感复制区和复制蛋白
多克隆位点，抗生素序列还有蔗糖致死基因

没有阳性转化子有没有可能跟你的培养条件有关，比如温度，因为你这是温度敏感，营养，因为你这是蔗糖致死，所以你有没有必要check一下这个
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hyacinth326
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10楼2013-04-02 20:51:17
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