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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教大家一个有关载体构建的问题，金币多多~~
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maychao123

银虫 (小有名气)
现在已经连上了么？我也遇到和你一样的问题，开始用的Thermo的Xho I和Pst I后来话过TAKARA的，感觉问题不是出在哪家生产的限制酶上，我的问题是一直到载体的双切和目的片段的双切都没问题，但是连接之后的化转都是假阳性，我是怀疑Xho I这个酶切位点不好用，因为本身这个酶切位点的连接效率就很低，但是没有其他的可用酶切位点，你可以试试连接的过程采用平末端连接的操作方法，酶切和连接之前先将DNA在65℃水浴10分钟再冰浴2分钟然后再加入酶，另外你用软件分析一下你的载体和片段各自的两个粘性末端至上游的50bp范围内是否有发卡结构，如果有的话可能会影响连接效率，目前我觉得我是碰运气连上的，不知道你进程怎么样了，希望能解决这个问题。
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hyacinth326
Don‘tforget3Oct
31楼2013-06-12 22:25:11
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
31楼: Originally posted by maychao123 at 2013-06-12 22:25:11
现在已经连上了么？我也遇到和你一样的问题，开始用的Thermo的Xho I和Pst I后来话过TAKARA的，感觉问题不是出在哪家生产的限制酶上，我的问题是一直到载体的双切和目的片段的双切都没问题，但是连接之后的化转都是假 ...

谢谢，我也连上了，我的问题出在抗性基因上了。
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32楼2013-06-13 08:35:27
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