20楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-03 13:03:31
换过感受态，也换过酶，还让别人给确认过连接体系，都不行，师妹也给做过实验。。。。...

21楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 14:30:33
先确定双酶切，你说用的限制性内切酶是NcoI和XhoI，是哪个公司的酶呢？
你有没有采取什么手段检测双酶切是正常的，比如你连的载体上是否也含有NcoI和XhoI的位点，因为载体上的位点也可能对你酶切的条带造成干扰， ...

18楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-03 13:01:23
两个片段（其实是载体+片段），只是都是通过PCR扩出来的。。。。你说的片段1800bp左右的PCR就好了，  5000多bp的那个还要用PCR 来扩。。。。如果有比较好的酶切位点，直接把那载体切下不要的那部分，然后片段两边加 ...

22楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-03 15:00:57
限制性内切酶用过宝生物和themo的快速内切酶，载体上是没有这两个酶的酶切位点的。
至于那个复制子是否work这个确实不太好说，不过我是这样做的，这个复制子来源于一个质粒，而这个质粒又是从另一个质粒上构建过来 ...

23楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-03 15:02:19
没有合适的酶切位点可以选择，我是这两个片段都通过pcr扩增出来之后，分别连接到克隆载体上，然后再酶切，再连接的。...

27楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-05 11:28:41
你何必分别连接到克隆载体上 在酶切 再连接呢

你直接设计引物的时候  在两端加上酶切位点（片段和载体都加）那样PCR后 直接用酶切，然后连接  不是方便很多？...

26楼: Originally posted by hsl5525 at 2013-04-04 22:58:35
能提供引物和序列嘛，帮你分析下，呵呵