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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教大家一个有关载体构建的问题，金币多多~~
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-03 13:03:31
换过感受态，也换过酶，还让别人给确认过连接体系，都不行，师妹也给做过实验。。。。...

先确定双酶切，你说用的限制性内切酶是NcoI和XhoI，是哪个公司的酶呢？
你有没有采取什么手段检测双酶切是正常的，比如你连的载体上是否也含有NcoI和XhoI的位点，因为载体上的位点也可能对你酶切的条带造成干扰，

在确认酶切没有问题之后，确认下连接是否有问题

如果以上都没有问题，那我觉得最有可能出问题的地方就是你那个温度敏感型复制子，这个有没有可能根本就不work，导致转化的产物无法复制，从而不能产生阳性转化子
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21楼2013-04-03 14:30:33
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 14:30:33
先确定双酶切，你说用的限制性内切酶是NcoI和XhoI，是哪个公司的酶呢？
你有没有采取什么手段检测双酶切是正常的，比如你连的载体上是否也含有NcoI和XhoI的位点，因为载体上的位点也可能对你酶切的条带造成干扰， ...

限制性内切酶用过宝生物和themo的快速内切酶，载体上是没有这两个酶的酶切位点的。
至于那个复制子是否work这个确实不太好说，不过我是这样做的，这个复制子来源于一个质粒，而这个质粒又是从另一个质粒上构建过来的，我把这两个质粒进行了序列比对，选取了公共区域，我觉得这个是没有问题的，然后这个复制子的序列我经过了不同公司测序都没有问题，才往下做的。
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22楼2013-04-03 15:00:57
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-03 13:01:23
两个片段（其实是载体+片段），只是都是通过PCR扩出来的。。。。你说的片段1800bp左右的PCR就好了，  5000多bp的那个还要用PCR 来扩。。。。如果有比较好的酶切位点，直接把那载体切下不要的那部分，然后片段两边加 ...

没有合适的酶切位点可以选择，我是这两个片段都通过pcr扩增出来之后，分别连接到克隆载体上，然后再酶切，再连接的。
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23楼2013-04-03 15:02:19
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
22楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-03 15:00:57
限制性内切酶用过宝生物和themo的快速内切酶，载体上是没有这两个酶的酶切位点的。
至于那个复制子是否work这个确实不太好说，不过我是这样做的，这个复制子来源于一个质粒，而这个质粒又是从另一个质粒上构建过来 ...

按照你目前的描述什么都是没有问题，但就是做不出来，真的很诡异
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
24楼2013-04-03 15:54:25
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不可能，我Q380270985 具体详说，不可能构不好！！！
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25楼2013-04-03 16:27:45
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hsl5525

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hyacinth326: 金币+5 2013-04-06 11:22:10
能提供引物和序列嘛，帮你分析下，呵呵
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26楼2013-04-04 22:58:35
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Leo_xin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-03 15:02:19
没有合适的酶切位点可以选择，我是这两个片段都通过pcr扩增出来之后，分别连接到克隆载体上，然后再酶切，再连接的。...

你何必分别连接到克隆载体上 在酶切 再连接呢

你直接设计引物的时候  在两端加上酶切位点（片段和载体都加）那样PCR后 直接用酶切，然后连接  不是方便很多？
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还有太多地方值得改进。
27楼2013-04-05 11:28:41
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by Leo_xin at 2013-04-05 11:28:41
你何必分别连接到克隆载体上 在酶切 再连接呢

你直接设计引物的时候  在两端加上酶切位点（片段和载体都加）那样PCR后 直接用酶切，然后连接  不是方便很多？...

加酶切位点和保护碱基直接切的方法也不是不可以，但是连到克隆载体上再酶切是为了能够保证酶切完全并且可以验证一下抗性是否有问题等。
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28楼2013-04-06 11:16:05
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by hsl5525 at 2013-04-04 22:58:35
能提供引物和序列嘛，帮你分析下，呵呵

当然可以啦，只是，我怎样把序列给你呢？
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29楼2013-04-06 11:16:38
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Jaaar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

换一个菌种试试?

既然你两个片断都验证过了没问题

何不尝试换另外一种感受态的菌种来做呢?
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30楼2013-04-17 13:58:03
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