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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教大家一个有关载体构建的问题，金币多多~~
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 20:51:17
不好意思，的确实我看错，
你的这个两个片段分别多大哈
质粒的温度敏感复制区和复制蛋白
多克隆位点，抗生素序列还有蔗糖致死基因

没有阳性转化子有没有可能跟你的培养条件有关，比如温度，因为你这是温度敏 ...

质粒的温度敏感复制区和复制蛋白一共1800bp左右，剩下的那些片段是在一起的，是从另一个质粒上pcr下来的，长度为5000多bp，我的培养温度是按照30度来的，培养基就是LB,也就是说没有蔗糖。
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11楼2013-04-02 20:54:46
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gyesang

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【答案】应助回帖

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11楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 20:54:46
质粒的温度敏感复制区和复制蛋白一共1800bp左右，剩下的那些片段是在一起的，是从另一个质粒上pcr下来的，长度为5000多bp，我的培养温度是按照30度来的，培养基就是LB,也就是说没有蔗糖。...

你的这个真的很诡异，温度敏感复制区和复制蛋白一共1800bp，这个好从载体上切下并能分辨出来，问题是不是有可能出在5000多bp上呢？这其中你是如何控制的呢？
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12楼2013-04-02 21:08:35
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 21:08:35
你的这个真的很诡异，温度敏感复制区和复制蛋白一共1800bp，这个好从载体上切下并能分辨出来，问题是不是有可能出在5000多bp上呢？这其中你是如何控制的呢？...

5000多这个片段我也是pcr下来之后连接到一个克隆载体上了，然后又从克隆载体上切下来的，这个5000多的片段的四环素抗性和蔗糖致死功能我都验证过的。
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13楼2013-04-02 21:13:22
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hyacinth326: 金币+5, ★有帮助 2013-04-03 13:04:14
引用回帖:
13楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 21:13:22
5000多这个片段我也是pcr下来之后连接到一个克隆载体上了，然后又从克隆载体上切下来的，这个5000多的片段的四环素抗性和蔗糖致死功能我都验证过的。...

你的感受态有没有问题，抗性平板也确定没有用错吧！
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14楼2013-04-02 21:46:37
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 21:46:37
你的感受态有没有问题，抗性平板也确定没有用错吧！...

恩，感受态没有问题，是经过验证的。抗性平板可能会有点问题，就是我发现四环素抗性的质粒转化感受态之后涂布平板长得菌比amp抗性的质粒转化长的要少一些，这个我在跟一个师姐聊天的时候她说她也发现这个问题了。
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15楼2013-04-02 22:05:08
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hyacinth326: 金币+5, ★有帮助 2013-04-03 13:03:39
引用回帖:
15楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 22:05:08
恩，感受态没有问题，是经过验证的。抗性平板可能会有点问题，就是我发现四环素抗性的质粒转化感受态之后涂布平板长得菌比amp抗性的质粒转化长的要少一些，这个我在跟一个师姐聊天的时候她说她也发现这个问题了。...

想不通这是为什么，实在不行，你可以请别人帮你做一次看看，都用别人的东西，有时候可能自己撞进死胡同了
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16楼2013-04-03 01:01:13
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jk_xdx

银虫 (小有名气)
哦，重新了解一下情况哈,
两个片段，1个载体，大小都是多少？
片段之间已经连接了没？
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17楼2013-04-03 11:22:29
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Leo_xin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-04-03 11:22:29
哦，重新了解一下情况哈,
两个片段，1个载体，大小都是多少？
片段之间已经连接了没？

两个片段（其实是载体+片段），只是都是通过PCR扩出来的。。。。你说的片段1800bp左右的PCR就好了，  5000多bp的那个还要用PCR 来扩。。。。如果有比较好的酶切位点，直接把那载体切下不要的那部分，然后片段两边加上酶切位点来连  岂不是更好。？
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还有太多地方值得改进。
18楼2013-04-03 13:01:23
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-04-03 11:22:29
哦，重新了解一下情况哈,
两个片段，1个载体，大小都是多少？
片段之间已经连接了没？

是要将两个片段连接成一个载体，不是将两个片段连到一个载体上，两个片段分别是1800bp和5000多bp
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19楼2013-04-03 13:02:43
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 01:01:13
想不通这是为什么，实在不行，你可以请别人帮你做一次看看，都用别人的东西，有时候可能自己撞进死胡同了...

换过感受态，也换过酶，还让别人给确认过连接体系，都不行，师妹也给做过实验。。。。
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20楼2013-04-03 13:03:31
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