10楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 20:51:17
不好意思，的确实我看错，
你的这个两个片段分别多大哈
质粒的温度敏感复制区和复制蛋白
多克隆位点，抗生素序列还有蔗糖致死基因

没有阳性转化子有没有可能跟你的培养条件有关，比如温度，因为你这是温度敏 ...

11楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 20:54:46
质粒的温度敏感复制区和复制蛋白一共1800bp左右，剩下的那些片段是在一起的，是从另一个质粒上pcr下来的，长度为5000多bp，我的培养温度是按照30度来的，培养基就是LB,也就是说没有蔗糖。...

12楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 21:08:35
你的这个真的很诡异，温度敏感复制区和复制蛋白一共1800bp，这个好从载体上切下并能分辨出来，问题是不是有可能出在5000多bp上呢？这其中你是如何控制的呢？...

13楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 21:13:22
5000多这个片段我也是pcr下来之后连接到一个克隆载体上了，然后又从克隆载体上切下来的，这个5000多的片段的四环素抗性和蔗糖致死功能我都验证过的。...

14楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 21:46:37
你的感受态有没有问题，抗性平板也确定没有用错吧！...

15楼: Originally posted by hyacinth326 at 2013-04-02 22:05:08
恩，感受态没有问题，是经过验证的。抗性平板可能会有点问题，就是我发现四环素抗性的质粒转化感受态之后涂布平板长得菌比amp抗性的质粒转化长的要少一些，这个我在跟一个师姐聊天的时候她说她也发现这个问题了。...

17楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-04-03 11:22:29
哦，重新了解一下情况哈,
两个片段，1个载体，大小都是多少？
片段之间已经连接了没？

17楼: Originally posted by jk_xdx at 2013-04-03 11:22:29
哦，重新了解一下情况哈,
两个片段，1个载体，大小都是多少？
片段之间已经连接了没？

16楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 01:01:13
想不通这是为什么，实在不行，你可以请别人帮你做一次看看，都用别人的东西，有时候可能自己撞进死胡同了...