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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PGEX-6P-1 载体构建 求帮忙
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] PGEX-6P-1 载体构建 求帮忙

情况是这样的，有个老师设计好的引物给我，让我克隆表达一个蛋白。我构建好几个载体准备开始表达，回头看发现下游引物有点问题。结果导致克隆进载体的目的基因的碱基数不是3的倍数，多出了一个碱基。也就是说向下移码了一位。

想请问大神们，这样还能做表达吗？这关系到我是继续往下做western还是重头开始。
我用重组PGEX-6P-1质粒SDS-PAGE发现很像蛋白表达出来了。

我在PGEX-6P-1多克隆位点下游发现这样的序列TGA C TGA C TGA，连续三个终止密码子，这是不是代表就算移码也没关系，我的蛋白有可能表达呢？
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1楼 2013-12-01 18:44:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yinchu1990

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-01 19:20:50
windleakey: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-12-02 21:23:00
是啊 下游没关系的
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2楼2013-12-01 18:49:04
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by windleakey at 2013-12-01 19:30:52
真的吗 要真是这样就太好了 请问这是个别质粒的特性 还是所有质粒都是这样的 因为我构建了好几个质粒...

一般没问题的，后面应该都会有密码子的，不过最好还是不要移码，不然会多一些氨基酸
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windleakey
7楼2013-12-01 21:51:20
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sinoer

铜虫 (小有名气)
TGA C TGA C TGA
这个载体可以，其他的不一定
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8楼2013-12-02 01:10:35
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-12-01 20:09:12
“结果导致克隆进载体的目的基因的碱基数不是3的倍数，多出了一个碱基。也就是说向下移码了一位。”能够说的再详细一点，这个多出来的一个碱基是在终止密码子前面还是后面呢？后面的话，是不影响的
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-12-01 19:21:53
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yinchu1990 at 2013-12-01 18:49:04
是啊 下游没关系的

真的吗 要真是这样就太好了 请问这是个别质粒的特性 还是所有质粒都是这样的 因为我构建了好几个质粒
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4楼2013-12-01 19:30:52
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-01 19:21:53
“结果导致克隆进载体的目的基因的碱基数不是3的倍数，多出了一个碱基。也就是说向下移码了一位。”能够说的再详细一点，这个多出来的一个碱基是在终止密码子前面还是后面呢？后面的话，是不影响的

感谢回复，我做分子时间不久所以很多地方可能有问题。我构建之前都没有考虑终止子位置的问题。
多出的这一个碱基是克隆进载体的目的基因的最后一个碱基，也就是双酶切位点中后一个酶切位点前面一个碱基。所以应该是在终止密码子的前面。
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5楼2013-12-01 19:39:16
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-02 01:39:44
引用回帖:
5楼: Originally posted by windleakey at 2013-12-01 19:39:16
感谢回复，我做分子时间不久所以很多地方可能有问题。我构建之前都没有考虑终止子位置的问题。
多出的这一个碱基是克隆进载体的目的基因的最后一个碱基，也就是双酶切位点中后一个酶切位点前面一个碱基。所以应该 ...

多出的这一个碱基是克隆进载体的目的基因的最后一个碱基，也就是双酶切位点中后一个酶切位点前面一个碱基。所以应该是在终止密码子的前面。
你要考虑目的蛋白是否提前终止和通读（READ THROUGH）.从你的描述看，可能没有提前终止，你要确认有没有终止密码字，因为多了一个碱基，载体本身的终止密码字可能移码了，你克隆基因的时候有没有包含终止密码子？
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6楼2013-12-01 20:49:08
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zh10246 at 2013-12-01 20:49:08
多出的这一个碱基是克隆进载体的目的基因的最后一个碱基，也就是双酶切位点中后一个酶切位点前面一个碱基。所以应该是在终止密码子的前面。
你要考虑目的蛋白是否提前终止和通读（READ THROUGH）.从你的描述看，可 ...

恩 克隆的基因没有终止密码子 只能指望质粒上的终止密码子了 这部分终于明白了 谢谢了
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9楼2013-12-02 21:21:25
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windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
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7楼: Originally posted by yinchu1990 at 2013-12-01 21:51:20
一般没问题的，后面应该都会有密码子的，不过最好还是不要移码，不然会多一些氨基酸...

恩 终于明白了 谢谢了
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10楼2013-12-02 21:21:43
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