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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PGEX-4T-1载体表达产物，GST标签的切除
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] PGEX-4T-1载体表达产物，GST标签的切除

最近做一个蛋白连接到GEX-4T-1上进行表达，但发现该蛋白检测人血清中的抗体的时候，有很高的假阳出现。现在考虑可能是GST标签的原因，因此想切除此标签。我们论坛上的虫友不知道有没有做过相关的，麻烦指导一下
1. 选用凝血酶进行切除， 看有人用人凝血酶（sigmaT6884 ），不知道效率如何
2.用GST纯化以后再切，切了以后再过柱子，流穿出来的就是我的样品，但凝血酶怎么除掉
3. 这样的话成本会不会很高

另外，有没有虫友有说明书，可不可以分享一下

不胜感激
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼 2013-10-15 16:10:29
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475502411

铜虫 (著名写手)
怎么没人回复呢？大家有人知道带标签的凝血酶哪个公司有卖吗？谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
2楼2013-10-16 15:40:21
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梦想很重要

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
3楼2013-10-16 22:42:31
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-17 10:40:30
1. 需要用带GST标签的酶
2. 成本的确很高, 主要是GST的树脂和酶
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2013-10-17 01:08:12
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-17 10:40:36
楼主不如把GST换成HIS标记,
首先你不确定这个假阳是GST引起的(万一是蛋白本身折叠的问题造成的呢?), 其次thrombin不一定好使(需要融合蛋白的结合部充分暴露在外面), 再有, 你也提到了, 切完后thrombin怎么去除掉也可能是个头痛的问题.
所以我建议楼主干脆换标签吧, 祝好运!
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5楼2013-10-17 04:17:30
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-10-17 03:17:30
楼主不如把GST换成HIS标记,
首先你不确定这个假阳是GST引起的(万一是蛋白本身折叠的问题造成的呢?), 其次thrombin不一定好使(需要融合蛋白的结合部充分暴露在外面), 再有, 你也提到了, 切完后thrombin怎么去除掉也 ...

但是换成His标签没办法纯化，挂Ni2+柱挂不上用的是28a，两端标签的也试过了，都关不上。所以才选择GST这个打标签的。
并且GST这个标签的融合蛋白还是不能完全挂上，有一大半是挂不上的，不知道怎么回事
His标签是一点也挂不上，没办法纯化
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
6楼2013-10-17 09:18:42
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 梦想很重要 at 2013-10-16 21:42:31
效率还可以啊啊 不用去掉

但是这个蛋白要用到体外诊断试剂上，检测人血液中的抗体，现在有家养存在，を怀疑是标签跟部分血液中的物质反应，所以想把标签却下来。有没有合适的酶推荐呢？谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
7楼2013-10-17 09:25:35
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-10-17 00:08:12
1. 需要用带GST标签的酶
2. 成本的确很高, 主要是GST的树脂和酶

您好，先不考虑成本的问题，我现在是想验证是不是标签的问题。您能不能给我推荐一下哪个公司的凝血酶是带标签的，我找了好久没找到。之前没有做过酶切融合蛋白的实验。麻烦多指导一点，谢谢
祝你好运
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
8楼2013-10-17 10:39:48
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
475502411: 金币+5 2013-10-17 13:32:29
475502411: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-10-17 13:32:57
475502411: 金币+5 2013-10-17 13:33:11
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-20 18:22:12
引用回帖:
7楼: Originally posted by 475502411 at 2013-10-17 09:25:35
但是这个蛋白要用到体外诊断试剂上，检测人血液中的抗体，现在有家养存在，を怀疑是标签跟部分血液中的物质反应，所以想把标签却下来。有没有合适的酶推荐呢？谢谢...

你现在也只是怀疑是因为你的标签影响你的实验结果，你可以做对照看下，你可以用其他的带GST的融合蛋白做为阴性对照看看，如果为阳性那就说明是你的标签影响，如果阴性对照成立就说明不是标签的影响撒，不要动不动就切标签。
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
9楼2013-10-17 12:49:06
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 0624410024 at 2013-10-17 11:49:06
你现在也只是怀疑是因为你的标签影响你的实验结果，你可以做对照看下，你可以用其他的带GST的融合蛋白做为阴性对照看看，如果为阳性那就说明是你的标签影响，如果阴性对照成立就说明不是标签的影响撒，不要动不动就 ...

哦，是的，这也是一个方法，を试一下，但是还是想知道能不能买到带标签的thrombin。这样酶切以后再过柱就可以得到干净的目的蛋白了
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
10楼2013-10-17 13:32:21
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