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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于pET32a载体构建后，双酶切鉴定不正确~求助
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浪人南

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于pET32a载体构建后，双酶切鉴定不正确~求助

情况是这样，我有一个1100的目标片段，准备连入pET32a质粒（5900），设计引物时已连上了酶切位点。
而后我PCR得到目的片段，回收，连T载体，测序，正确（包括酶切位点）
而后我双酶切T载体，及pET32啊，回收T载体上1100的片段已经5900的pET32a
T4连接过夜，转化凃板，挑单菌落。这时我用特异引物进行菌液PCR,能P出目的条带；
为了进一步坚定，我提了质粒进行双酶切，这时问题来了，切出的条带居然是1100和3000左右的条带
这是怎么回事呢，我用pET32a的序列查了下确实没同样的酶切位点会把载体切断，那怎个3000是怎么出来的呢？
而且连涂了好几个板，出的都是这一摸一样的结果，蛋疼啊，求帮助~~~谢谢
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1楼 2013-11-16 20:36:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-19 15:07:49
五楼的有点对。另外1000bp没有链接到t载体上的必要，不过我说的也是我们做的，你们的情况还得具体分析。这种情况我也遇到过，很迷茫，分子生物这东西有时候理论上透彻的一塌糊涂，但是操作起来结果就是对不上，很奇妙的东西。
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我不会！
6楼2013-11-18 15:19:06
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-17 12:35:26
回收pET32a载体片段后是否电泳检查了大小？此外PCR验证克隆时可能出现假阳性。提出阳性克隆的质粒单酶切看看大小是否是7K还是4K多。
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2楼2013-11-17 02:45:06
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-17 12:35:31
直接把质粒送去测序鉴定就知道有没有构建成功了，1000bp的话，测通很容易
如果没有成功，就不用考虑3000bp的事情
如果测序是对的，那你可以把双酶切的位点换一下，pet32上面酶切位点也还不少
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3楼2013-11-17 10:46:13
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-19 15:07:36
可以直接连接pET32a，省去T载体看看，这样还快，少一轮克隆。
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4楼2013-11-17 23:06:46
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-19 15:07:42
首先，你的目的片段，并没有成功连接到pET32a.现在还是在T载体上，3000的条带是T载体。
其次，菌液PCR说明不了问题。如果要说明问题，上下游引物要一个在载体上，一个在目的片段上。
再次，T载体跟pET32a上面都有很多多克隆位点，设计的时候要分析透彻，看清楚。

PS双酶切一定要酶切彻底，这很关键。不同的酶buffer不一样。如果没有共用buffer，可以分部酶切。

希望能帮到你。
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5楼2013-11-18 15:07:03
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浪人南

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-17 02:45:06
回收pET32a载体片段后是否电泳检查了大小？此外PCR验证克隆时可能出现假阳性。提出阳性克隆的质粒单酶切看看大小是否是7K还是4K多。

啊，这个失误了，回收后我没有电泳检查，这步是不是必要的？
我提出单酶切看了下，真是是4K多，我想那个3K的多载体它是怎么出来，又连上的呢
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7楼2013-11-19 09:24:08
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浪人南

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by huahu3600 at 2013-11-18 15:07:03
首先，你的目的片段，并没有成功连接到pET32a.现在还是在T载体上，3000的条带是T载体。
其次，菌液PCR说明不了问题。如果要说明问题，上下游引物要一个在载体上，一个在目的片段上。
再次，T载体跟pET32a上面都有 ...

嗯，但这个不会呀，我是双酶切T载体后回收的目的条带，进行连接的，不会是T载体的
不过使用菌液PCR这点倒是给我提了个醒，我要设计一个载体，一个目的片段的引物
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8楼2013-11-19 10:46:39
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-19 15:07:56
引用回帖:
8楼: Originally posted by 浪人南 at 2013-11-19 10:46:39
嗯，但这个不会呀，我是双酶切T载体后回收的目的条带，进行连接的，不会是T载体的
不过使用菌液PCR这点倒是给我提了个醒，我要设计一个载体，一个目的片段的引物...

双酶切很容易酶切不完全，就算回收，也不可避免地收T载体+目的片段这个质粒的影响。要知道质粒，哪怕是枪上残留一点，也会转化出很多克隆的。
我就吃过好几次药。
所以，爽气点，自信点，直接连PET32a，如果有合适酶切位点的话。
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9楼2013-11-19 10:58:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 浪人南 at 2013-11-19 09:24:08
啊，这个失误了，回收后我没有电泳检查，这步是不是必要的？
我提出单酶切看了下，真是是4K多，我想那个3K的多载体它是怎么出来，又连上的呢...

如果酶切后做的胶回收，回收后的电泳检查一般可以不做。可能你做酶切时酶有星号性，把载体片段多切掉了一段。
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10楼2013-11-20 01:51:43
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