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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双顺反子 表达载体的构建——求助！
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单单VS双双

新虫 (初入文坛)

[交流] 双顺反子 表达载体的构建——求助！

正在构建双顺反子表达载体，用的是pet-32a 有几个问题请教高人指点
1、第一个基因需不需要ATG还是直接用成熟肽，终止密码子需不需要去掉；
2、第二个基因之前除了要加RBS序列还需要添加别的序列吗，ATG是否需要带着；3、第二个基因从哪里开始编码是否RBS会被识别成三联密码子翻译成相应氨基酸；
4、第二个基因不加RBS，第一个基因不加终止密码子，是否会使两条多肽串联起来，这样形式的蛋白经过变性复性能否具有相应的生物学活性（两个多肽，是同一蛋白的两个亚单位）
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1楼 2013-08-27 23:50:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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单单VS双双: 金币+5 2013-08-28 10:19:09
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1. 如果你指向表达成熟肽，可以去掉原序列里的信号肽编码序列，但是需要有ATG作为起始密码子。这样表达出来的产物比成熟肽多一个Met。如果你不想把两个基因融合表达，就不要去掉第一个序列的终止密码子。
2. 第二个基因之前不用加核糖体结合位点。pet-32a用的是强启动子，没有终止子序列的情况下核糖体不会脱落。第二个基因的ATG需要保留，第二个基因就是从其ATG开设表达。
3. 两个序列之间不用保持阅读框，除非你想做成融合蛋白。
3. 融合蛋白是否保留原来的活性的确要看是否正确折叠成独立结构，一般会在两个蛋白之间加linker。
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2楼2013-08-28 02:29:54
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单单VS双双

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-28 02:29:54
1. 如果你指向表达成熟肽，可以去掉原序列里的信号肽编码序列，但是需要有ATG作为起始密码子。这样表达出来的产物比成熟肽多一个Met。如果你不想把两个基因融合表达，就不要去掉第一个序列的终止密码子。
2. 第二个 ...

感谢老师帮助，受益匪浅，还有几个地方不太明白
1、第一个基因的翻译起始位点应该是载体RBS下游的第一个ATG吧，也就是说在表达我目的片段的氨基酸之前还要表达载体上的氨基酸100多个，这样的话我第一个基因添加ATG的作用是什么呢，第一个基因表达出来的蛋白是不是就是各种Tag 加上我的目的蛋白的融合蛋白？
2、载体两翼都有His.tag有没有必要都保留？
3、第一个基因如果带着终止密码子，第二个基因的转录和翻译会不会受到影响？第二个基因我可以用TAA做终止密码子，不让下游His.tag 表达吗？
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3楼2013-08-28 10:18:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
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3楼: Originally posted by 单单VS双双 at 2013-08-28 10:18:26
感谢老师帮助，受益匪浅，还有几个地方不太明白
1、第一个基因的翻译起始位点应该是载体RBS下游的第一个ATG吧，也就是说在表达我目的片段的氨基酸之前还要表达载体上的氨基酸100多个，这样的话我第一个基因添加AT ...

1. 你可以选择不同的酶切位点克隆来实现表达产物带什么tag。pET-32a的确可以在N端融合多个tag，并且这些tag是可以在纯化后切除的。这种情况，你实际上是先表达出带标签的融合蛋白，所以第一个目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的阅读框与前面的融合标签相符，避免移码。
2. his-tag留一个就可以了。载体这样设计是为了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端对活性很重要，只有一边的标签纯化出来的蛋白有活性。
3. 第一个基因的终止密码子不会影响第二个基因的表达，有终止密码子可以避免形成融合蛋白。当然如果你想做融合表达的话，应该去掉第一个基因的终止密码子。第二个基因的TAA如果保留，表达出来的蛋白的C端是没有his-tag。
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4楼2013-08-28 11:40:12
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单单VS双双

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-28 11:40:12
1. 你可以选择不同的酶切位点克隆来实现表达产物带什么tag。pET-32a的确可以在N端融合多个tag，并且这些tag是可以在纯化后切除的。这种情况，你实际上是先表达出带标签的融合蛋白，所以第一个目的基因的ATG可以不要 ...

之前我一直以为RBS序列必须得有呢！确认一下
1、 “没有终止子序列的情况下核糖体不会脱落”您说的这个终止子是指terminator 不是终止密码子是吧？
2、如果涉及到共表达的两个蛋白的纯化是不是两边的His.tag都得保留啊；
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5楼2013-08-28 12:38:24
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:20
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-28 02:29:54
1. 如果你指向表达成熟肽，可以去掉原序列里的信号肽编码序列，但是需要有ATG作为起始密码子。这样表达出来的产物比成熟肽多一个Met。如果你不想把两个基因融合表达，就不要去掉第一个序列的终止密码子。
2. 第二个 ...

2. 用不用强启动子和需不需要RBS有毛线关系。 启动子只控制转录，核糖体结合位点是必须的，关于连续的bicistron 表达具体可以参考以下三篇文章。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090

结论就是，如果使用E coli本身启动子，那么第二个CDS翻译强度首先会随着距起始位点变远而下降（当然在使用T7 RNAP时候，在2-3Kbp以内可能不是很明显）

如果第一段CDS的stop codon 出现在RBS后面，那么第一个CDS的翻译会帮助解除mRNA的二级结构，从而帮助第二个cistron的翻译(强度只取决于RBS的序列，和第二个CDS的起始部分无关，没有RBS几乎不翻译)

如果第一段CDS的Stop codon在第二个RBS之前，那么第二个CDS的翻译很不好预测，可以通过RBS二级结构进行一些分析，不过准确率大概就50%（具体看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ）

所以此时如果想有效的去除5‘sequence 对第二个cistron的影响，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，当然最简单的方法就是再克隆一遍启动子往后的序列，这样最保险。
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6楼2013-08-28 12:49:21
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单单VS双双

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-08-28 12:49:21
2. 用不用强启动子和需不需要RBS有毛线关系。 启动子只控制转录，核糖体结合位点是必须的，关于连续的bicistron 表达具体可以参考以下三篇文章。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465

http://www.n ...

1、我的两个多肽加起来有600多bp，第二个cds翻译的效率应该不会受到很大影响吧？
2、“如果第一段CDS的stop codon 出现在RBS后面，那么第一个CDS的翻译会帮助解除mRNA的二级结构” 什么意思啊，是不是说第二个基因的RBS也同时作为第一个基因的编码序列啊？
3、“不过准确率大概就50%”这个概率说明什么， 是不能很好的识别第二个基因的起始密码子吗？
4、求教关于两个基因之间的序列设计以及第二个基因RBS与ATG之间的序列设计；
谢谢
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7楼2013-08-28 13:54:02
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
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1. 距离不重要，但rbs的interaction只和序列有关，影响未知

2. 是的比如我给你的第一篇文章出现类似（aggaggt）tttaatg的序列时如果第一个蛋白质翻译在TAAtg的TAA终止，（括号内是RBS），那么如果从最后的ATG起始时可以保住消除mRNA二级结构

3. 指你如果用自由能预测RBS强度

4. 省事得话直接另外加一个promoter，这样是最不用操心的。 其次把你的第二个RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 这里算下活性，和去掉第一段cds作为上游序列时比较下，差异不大，并且数字还可以（至少几K吧），可以考虑
更麻烦但是理论上可以用的方法，参考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出现在第一个蛋白里，一般不符合你的情况。），在第一个Stop condon后面加一个RiboJ序列（最好稍微有点距离），这样最后mRNA会被RiboJ分成两段独立的mRNA
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8楼2013-08-28 22:00:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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5楼: Originally posted by 单单VS双双 at 2013-08-28 12:38:24
之前我一直以为RBS序列必须得有呢！确认一下
1、 “没有终止子序列的情况下核糖体不会脱落”您说的这个终止子是指terminator 不是终止密码子是吧？
2、如果涉及到共表达的两个蛋白的纯化是不是两边的His.tag都得 ...

1. 我说的终止子就是terminator，不是终止密码子。
2. 一个his-tag做纯化就足够了。两个有时候反而有问题。而且多加一个tag增加了对蛋白的折叠和活性影响的未知因素。不过做克隆时为了保险起见，往往C端和N端tag都做。
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9楼2013-08-28 22:12:31
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