| 查看: 5288 | 回复: 8 | ||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||||
[交流]
双顺反子 表达载体的构建——求助！
|
||||||
|
正在构建双顺反子表达载体，用的是pet-32a 有几个问题请教高人指点 1、第一个基因需不需要ATG还是直接用成熟肽，终止密码子需不需要去掉； 2、第二个基因之前除了要加RBS序列还需要添加别的序列吗，ATG是否需要带着；3、第二个基因从哪里开始编码是否RBS会被识别成三联密码子翻译成相应氨基酸； 4、第二个基因不加RBS，第一个基因不加终止密码子，是否会使两条多肽串联起来，这样形式的蛋白经过变性复性能否具有相应的生物学活性（两个多肽，是同一蛋白的两个亚单位） |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 药学科研资料 | 核酸方面 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有149人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- pMD18-T载体连接了目的片段后双酶切鉴定出现了好多条带 怎么回事?
已经有6人回复
- 组氨酸标签的问题
已经有27人回复
- 一条成熟mRNA可否翻译两条蛋白？
已经有9人回复
- 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂
已经有12人回复
- micro ? small ? short ? RNA
已经有6人回复
- 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
已经有5人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌有的是表达载体的宿主，有些事克隆载体的宿主，他们的区别在哪�
已经有10人回复
- 【求助/交流】PET32a 表达载体和PMD19-T 克隆载体，是否可以用之前养在DH5a里扩增？
已经有12人回复
- 【求助/交流】真核细胞到底是单顺反子还是多顺反子？？？
已经有5人回复
- 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌
已经有11人回复
- 【求助/交流】什么是组成型表达载体
已经有4人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】在构建基因表达载体的时候什么时候需要人为地在上面加上启动子？
已经有6人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
- 【求助/交流】原核表达载体pGEX-4T-1对应的表达菌株
已经有6人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题
已经有6人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
招收调剂生，动物医学专业
+1/84
-
天津理工大学国家杰青王铁课题组招收2026年博士研究生
+1/82
-
招收材料与化学相关专业硕士研究生
+1/81
-
温州大学吕晶晶课题组2026年招生
+1/76
-
散金币，求好运，祝面上顺利！
+2/66
-
Alicat 层流压差质量流量控制器在新型硅碳负极流化床的应用- 艾里卡特（Alicat）
+3/52
-
武汉高校接受研究生调剂，材料、化学、纺织方向
+2/46
-
天津城建大学招收物理、化学或者生物调剂生一名，前往天津大学联合培养
+1/37
-
PBAT溶解做成乳液
+1/36
-
上海交大招聘高分子方向博士后及科研助理
+1/36
-
从专科一路到211硕士，到TOP5博士，也想进高校体制
+1/30
-
中科院物理所二维材料方向招收推免研究生
+1/23
-
浙江中医药大学副校长团队招聘药学/生物信息学等方向高校教师7名，报名通道已开启
+1/15
-
招收专业代码08的学硕！
+1/15
-
南京林业大学-国家级青年人才团队 招2026级申请考核制博士（合成化学、植物化学方向）
+1/13
-
宁波东方理工大学余鹏课题组2026年上海交大联培博士生、博士后、科研助理招聘
+1/7
-
华中科技大学管理学院招聘社会用工（科研助理）1名
+1/5
-
欢迎生物与医药、药学、化学等相关专业的同学
+1/4
-
“机械、材料”招生
+1/1
-
211/双一流石河子大学化学化工学院-电池/电催化研究方向
+1/1
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
1. 距离不重要，但rbs的interaction只和序列有关，影响未知 2. 是的比如我给你的第一篇文章出现类似（aggaggt）tttaatg的序列时如果第一个蛋白质翻译在TAAtg的TAA终止，（括号内是RBS），那么如果从最后的ATG起始时可以保住消除mRNA二级结构 3. 指你如果用自由能预测RBS强度 4. 省事得话直接另外加一个promoter，这样是最不用操心的。 其次把你的第二个RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 这里算下活性，和去掉第一段cds作为上游序列时比较下，差异不大，并且数字还可以（至少几K吧），可以考虑 更麻烦但是理论上可以用的方法，参考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出现在第一个蛋白里，一般不符合你的情况。），在第一个Stop condon后面加一个RiboJ序列（最好稍微有点距离），这样最后mRNA会被RiboJ分成两段独立的mRNA |
8楼2013-08-28 22:00:55
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单单VS双双: 金币+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单单VS双双: 金币+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
|
1. 如果你指向表达成熟肽，可以去掉原序列里的信号肽编码序列，但是需要有ATG作为起始密码子。这样表达出来的产物比成熟肽多一个Met。如果你不想把两个基因融合表达，就不要去掉第一个序列的终止密码子。 2. 第二个基因之前不用加核糖体结合位点。pet-32a用的是强启动子，没有终止子序列的情况下核糖体不会脱落。第二个基因的ATG需要保留，第二个基因就是从其ATG开设表达。 3. 两个序列之间不用保持阅读框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原来的活性的确要看是否正确折叠成独立结构，一般会在两个蛋白之间加linker。 |
2楼2013-08-28 02:29:54
3楼2013-08-28 10:18:26
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
|
1. 你可以选择不同的酶切位点克隆来实现表达产物带什么tag。pET-32a的确可以在N端融合多个tag，并且这些tag是可以在纯化后切除的。这种情况，你实际上是先表达出带标签的融合蛋白，所以第一个目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的阅读框与前面的融合标签相符，避免移码。 2. his-tag留一个就可以了。载体这样设计是为了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端对活性很重要，只有一边的标签纯化出来的蛋白有活性。 3. 第一个基因的终止密码子不会影响第二个基因的表达，有终止密码子可以避免形成融合蛋白。当然如果你想做融合表达的话，应该去掉第一个基因的终止密码子。第二个基因的TAA如果保留，表达出来的蛋白的C端是没有his-tag。 |
4楼2013-08-28 11:40:12
