| 查看: 5254 | 回复: 8 | ||||||
[交流]
双顺反子 表达载体的构建——求助！
|
|
正在构建双顺反子表达载体，用的是pet-32a 有几个问题请教高人指点 1、第一个基因需不需要ATG还是直接用成熟肽，终止密码子需不需要去掉； 2、第二个基因之前除了要加RBS序列还需要添加别的序列吗，ATG是否需要带着；3、第二个基因从哪里开始编码是否RBS会被识别成三联密码子翻译成相应氨基酸； 4、第二个基因不加RBS，第一个基因不加终止密码子，是否会使两条多肽串联起来，这样形式的蛋白经过变性复性能否具有相应的生物学活性（两个多肽，是同一蛋白的两个亚单位） |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 药学科研资料 | 核酸方面 |
» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有248人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- pMD18-T载体连接了目的片段后双酶切鉴定出现了好多条带 怎么回事?
已经有6人回复
- 组氨酸标签的问题
已经有27人回复
- 一条成熟mRNA可否翻译两条蛋白？
已经有9人回复
- 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂
已经有12人回复
- micro ? small ? short ? RNA
已经有6人回复
- 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
已经有5人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌有的是表达载体的宿主，有些事克隆载体的宿主，他们的区别在哪�
已经有10人回复
- 【求助/交流】PET32a 表达载体和PMD19-T 克隆载体，是否可以用之前养在DH5a里扩增？
已经有12人回复
- 【求助/交流】真核细胞到底是单顺反子还是多顺反子？？？
已经有5人回复
- 【求助/交流】目的基因连接表达载体后涂板不长菌
已经有11人回复
- 【求助/交流】什么是组成型表达载体
已经有4人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】在构建基因表达载体的时候什么时候需要人为地在上面加上启动子？
已经有6人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
- 【求助/交流】原核表达载体pGEX-4T-1对应的表达菌株
已经有6人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题
已经有6人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
江西景德镇某大学接受调剂：环境科学与工程专业
+1/179
-
招聘科研助理
+1/178
-
87 年东北人定居苏州，诚寻携手余生的你
+1/151
-
安徽农业大学李亚辉教授招收生物、化学、农药学、植保类2026级博士研究生
+1/83
-
太原科技大学材料科学与工程学院招收金属材料类博士一名
+1/81
-
澳大利亚昆士兰大学化工学院吕妙强课题组招收项目支持的全奖博士生2名
+1/80
-
重庆大学李延军课题组招聘有机/药化方向青年教师、博士后和研究助理数名
+1/78
-
齐鲁工业大学轻工学部博导课题组招收两名硕士调剂生
+1/39
-
哈尔滨工业大学博士招生
+1/33
-
算法实习生招聘（驻地郑州，可提供实习证明、转正机会）
+1/20
-
26届计算机、电子信息类、电科、控制、通信考研T j信息pp骏：74+08+76+6+20/
+1/14
-
推荐一款可以AI辅助写作的Latex编辑器SmartLatexEditor，超级好用，推荐试试
+1/9
-
安徽农业大学许云辉教授课题组招收材料类、化工类、医学类等工科专硕学硕考研调剂
+1/9
-
you can see 26届计算机、电子信息类、电科、控制考研T j信息pp骏：74+08+76+6+20/
+1/5
-
诚邀有志之士加入江苏大学环境学院合成生物学课题组！(长期接收学硕专硕、硕博连读)
+1/4
-
中科院深圳先进技术研究院成会明院士/唐永炳杰青团队拟招聘博士后若干名。
+1/4
-
西安工程大学环境与化学工程学院26年硕士研究生招生咨询（26年9月入学）
+1/4
-
澳科大诚招2026年秋季药物递送/生物材料方向硕士研究生（倒计时最后一周）
+1/3
-
【招聘科研助理】四川大学华西医院Rajeev Kumar助理研究员课题组
+1/2
-
一志愿中科大电子信息372分
+1/2
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单单VS双双: 金币+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
单单VS双双: 金币+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
|
1. 如果你指向表达成熟肽，可以去掉原序列里的信号肽编码序列，但是需要有ATG作为起始密码子。这样表达出来的产物比成熟肽多一个Met。如果你不想把两个基因融合表达，就不要去掉第一个序列的终止密码子。 2. 第二个基因之前不用加核糖体结合位点。pet-32a用的是强启动子，没有终止子序列的情况下核糖体不会脱落。第二个基因的ATG需要保留，第二个基因就是从其ATG开设表达。 3. 两个序列之间不用保持阅读框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原来的活性的确要看是否正确折叠成独立结构，一般会在两个蛋白之间加linker。 |
2楼2013-08-28 02:29:54
3楼2013-08-28 10:18:26
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
|
1. 你可以选择不同的酶切位点克隆来实现表达产物带什么tag。pET-32a的确可以在N端融合多个tag，并且这些tag是可以在纯化后切除的。这种情况，你实际上是先表达出带标签的融合蛋白，所以第一个目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的阅读框与前面的融合标签相符，避免移码。 2. his-tag留一个就可以了。载体这样设计是为了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端对活性很重要，只有一边的标签纯化出来的蛋白有活性。 3. 第一个基因的终止密码子不会影响第二个基因的表达，有终止密码子可以避免形成融合蛋白。当然如果你想做融合表达的话，应该去掉第一个基因的终止密码子。第二个基因的TAA如果保留，表达出来的蛋白的C端是没有his-tag。 |
4楼2013-08-28 11:40:12
5楼2013-08-28 12:38:24
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:20
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:20
|
2. 用不用强启动子和需不需要RBS有毛线关系。 启动子只控制转录，核糖体结合位点是必须的，关于连续的bicistron 表达具体可以参考以下三篇文章。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090 结论就是，如果使用E coli本身启动子，那么第二个CDS翻译强度首先会随着距起始位点变远而下降（当然在使用T7 RNAP时候，在2-3Kbp以内可能不是很明显） 如果第一段CDS的stop codon 出现在RBS后面，那么第一个CDS的翻译会帮助解除mRNA的二级结构，从而帮助第二个cistron的翻译(强度只取决于RBS的序列，和第二个CDS的起始部分无关，没有RBS几乎不翻译) 如果第一段CDS的Stop codon在第二个RBS之前，那么第二个CDS的翻译很不好预测，可以通过RBS二级结构进行一些分析，不过准确率大概就50%（具体看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ） 所以此时如果想有效的去除5‘sequence 对第二个cistron的影响，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，当然最简单的方法就是再克隆一遍启动子往后的序列，这样最保险。 |
6楼2013-08-28 12:49:21
7楼2013-08-28 13:54:02
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
1. 距离不重要，但rbs的interaction只和序列有关，影响未知 2. 是的比如我给你的第一篇文章出现类似（aggaggt）tttaatg的序列时如果第一个蛋白质翻译在TAAtg的TAA终止，（括号内是RBS），那么如果从最后的ATG起始时可以保住消除mRNA二级结构 3. 指你如果用自由能预测RBS强度 4. 省事得话直接另外加一个promoter，这样是最不用操心的。 其次把你的第二个RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 这里算下活性，和去掉第一段cds作为上游序列时比较下，差异不大，并且数字还可以（至少几K吧），可以考虑 更麻烦但是理论上可以用的方法，参考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出现在第一个蛋白里，一般不符合你的情况。），在第一个Stop condon后面加一个RiboJ序列（最好稍微有点距离），这样最后mRNA会被RiboJ分成两段独立的mRNA |
8楼2013-08-28 22:00:55
9楼2013-08-28 22:12:31
