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双顺反子 表达载体的构建——求助！
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正在构建双顺反子表达载体，用的是pet-32a 有几个问题请教高人指点 1、第一个基因需不需要ATG还是直接用成熟肽，终止密码子需不需要去掉； 2、第二个基因之前除了要加RBS序列还需要添加别的序列吗，ATG是否需要带着；3、第二个基因从哪里开始编码是否RBS会被识别成三联密码子翻译成相应氨基酸； 4、第二个基因不加RBS，第一个基因不加终止密码子，是否会使两条多肽串联起来，这样形式的蛋白经过变性复性能否具有相应的生物学活性（两个多肽，是同一蛋白的两个亚单位） |
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单单VS双双: 金币+5 2013-08-28 10:19:09
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:06
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1. 如果你指向表达成熟肽，可以去掉原序列里的信号肽编码序列，但是需要有ATG作为起始密码子。这样表达出来的产物比成熟肽多一个Met。如果你不想把两个基因融合表达，就不要去掉第一个序列的终止密码子。 2. 第二个基因之前不用加核糖体结合位点。pet-32a用的是强启动子，没有终止子序列的情况下核糖体不会脱落。第二个基因的ATG需要保留，第二个基因就是从其ATG开设表达。 3. 两个序列之间不用保持阅读框，除非你想做成融合蛋白。 3. 融合蛋白是否保留原来的活性的确要看是否正确折叠成独立结构，一般会在两个蛋白之间加linker。 |
2楼2013-08-28 02:29:54
3楼2013-08-28 10:18:26
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-28 19:21:27
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1. 你可以选择不同的酶切位点克隆来实现表达产物带什么tag。pET-32a的确可以在N端融合多个tag，并且这些tag是可以在纯化后切除的。这种情况，你实际上是先表达出带标签的融合蛋白，所以第一个目的基因的ATG可以不要，但要注意序列的阅读框与前面的融合标签相符，避免移码。 2. his-tag留一个就可以了。载体这样设计是为了克隆方便。有些蛋白的N端或者C端对活性很重要，只有一边的标签纯化出来的蛋白有活性。 3. 第一个基因的终止密码子不会影响第二个基因的表达，有终止密码子可以避免形成融合蛋白。当然如果你想做融合表达的话，应该去掉第一个基因的终止密码子。第二个基因的TAA如果保留，表达出来的蛋白的C端是没有his-tag。 |
4楼2013-08-28 11:40:12
5楼2013-08-28 12:38:24
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-28 13:53:20
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2. 用不用强启动子和需不需要RBS有毛线关系。 启动子只控制转录，核糖体结合位点是必须的，关于连续的bicistron 表达具体可以参考以下三篇文章。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23474465 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23034349 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22983090 结论就是，如果使用E coli本身启动子，那么第二个CDS翻译强度首先会随着距起始位点变远而下降（当然在使用T7 RNAP时候，在2-3Kbp以内可能不是很明显） 如果第一段CDS的stop codon 出现在RBS后面，那么第一个CDS的翻译会帮助解除mRNA的二级结构，从而帮助第二个cistron的翻译(强度只取决于RBS的序列，和第二个CDS的起始部分无关，没有RBS几乎不翻译) 如果第一段CDS的Stop codon在第二个RBS之前，那么第二个CDS的翻译很不好预测，可以通过RBS二级结构进行一些分析，不过准确率大概就50%（具体看 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n10/full/nbt.1568.html ） 所以此时如果想有效的去除5‘sequence 对第二个cistron的影响，可以使用我上面提到的第二 三篇文章的方法，当然最简单的方法就是再克隆一遍启动子往后的序列，这样最保险。 |
6楼2013-08-28 12:49:21
7楼2013-08-28 13:54:02
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1. 距离不重要，但rbs的interaction只和序列有关，影响未知 2. 是的比如我给你的第一篇文章出现类似（aggaggt）tttaatg的序列时如果第一个蛋白质翻译在TAAtg的TAA终止，（括号内是RBS），那么如果从最后的ATG起始时可以保住消除mRNA二级结构 3. 指你如果用自由能预测RBS强度 4. 省事得话直接另外加一个promoter，这样是最不用操心的。 其次把你的第二个RBS 扔到https://salis.psu.edu/software/ 这里算下活性，和去掉第一段cds作为上游序列时比较下，差异不大，并且数字还可以（至少几K吧），可以考虑 更麻烦但是理论上可以用的方法，参考上面的第二篇文章（第一篇文章需要特定RBS序列出现在第一个蛋白里，一般不符合你的情况。），在第一个Stop condon后面加一个RiboJ序列（最好稍微有点距离），这样最后mRNA会被RiboJ分成两段独立的mRNA |
8楼2013-08-28 22:00:55
9楼2013-08-28 22:12:31
