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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] PGEX-6P-1 载体构建 求帮忙

情况是这样的,有个老师设计好的引物给我,让我克隆表达一个蛋白。我构建好几个载体准备开始表达,回头看发现下游引物有点问题。结果导致克隆进载体的目的基因的碱基数不是3的倍数,多出了一个碱基。也就是说向下移码了一位。

想请问大神们,这样还能做表达吗?这关系到我是继续往下做western还是重头开始。
我用重组PGEX-6P-1质粒SDS-PAGE发现很像蛋白表达出来了。

我在PGEX-6P-1多克隆位点下游发现这样的序列TGA C TGA C TGA,连续三个终止密码子,这是不是代表就算移码也没关系,我的蛋白有可能表达呢?
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windleakey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by zh10246 at 2013-12-01 20:49:08
多出的这一个碱基是克隆进载体的目的基因的最后一个碱基,也就是双酶切位点中后一个酶切位点前面一个碱基。所以应该是在终止密码子的前面。
你要考虑目的蛋白是否提前终止和通读(READ THROUGH).从你的描述看,可 ...

恩 克隆的基因没有终止密码子 只能指望质粒上的终止密码子了 这部分终于明白了 谢谢了
9楼2013-12-02 21:21:25
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-01 19:20:50
windleakey: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-12-02 21:23:00
是啊 下游没关系的
2楼2013-12-01 18:49:04
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gyesang

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+1, 感谢发帖应助,帮助虫子 2013-12-01 20:09:12
“结果导致克隆进载体的目的基因的碱基数不是3的倍数,多出了一个碱基。也就是说向下移码了一位。”能够说的再详细一点,这个多出来的一个碱基是在终止密码子前面还是后面呢?后面的话,是不影响的
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-12-01 19:21:53
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windleakey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yinchu1990 at 2013-12-01 18:49:04
是啊 下游没关系的

真的吗 要真是这样就太好了 请问这是个别质粒的特性 还是所有质粒都是这样的 因为我构建了好几个质粒
4楼2013-12-01 19:30:52
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