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slk8349

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建载体后,菌液PCR,没有目的条带!!! 已有1人参与

我是从T载体上将目的片段用xbaⅠ,和hindⅢ直接双酶切,与我的载体pcmv连接,转化后,平板上菌落长得很好,可是做菌液PCR鉴定是,根本P不出来目的片段,请问是哪里有问题啊?看来好多的帖子,大家都说是不长菌落,可是我的菌落长的很好啊,而且我重复做了两次,结果都一样!我也做了酶切鉴定,xbaⅠ,和hindⅢ可以准确的从T载体上切下我的目的片段,而且,对PCMV也做了酶切,效果很好!求高人指点!!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
slk8349(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助交流! 2013-04-28 03:25:46
PCR用的引物在载体上还是在目的片段上?菌液PCR是否做了正负对照,确保PCR没有问题?转化时是否做了载体自连对照?此外,如果菌液PCR不成功的话,也可以提几个克隆的质粒做酶切鉴定。
2楼2013-04-28 03:09:59
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wxf8470

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有可能是引物不好使,酶切鉴定无误后可以送去测序。
3楼2013-04-28 10:20:12
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR,最重要的是引物。当然在其他条件大致没有什么问题的情况下。
4楼2013-04-28 10:41:54
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senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果连接效率高的话,直接提取质粒酶切鉴定不就可以了!
做实验就是和上帝玩游戏!
5楼2013-04-28 15:29:00
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mamjun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


slk8349(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-03 20:23:44
如果pcr用的是片段上两个引物的话,为什么要先酶切再连接呢,不可以直接pcr扩增目的片段再了解质粒吗=-O
pcr鉴定用引物是质粒上引物加片段上引物吗,是的话要考虑片段插入方向
楼主解决了吗,是什么原因?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2013-05-02 22:41:00
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shsDerek

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以酶切鉴定试试,如果没有的话,应该没有连进去
7楼2013-05-03 11:04:16
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飞翔的麦穗

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可能被切得太散了,我之前也遇到过这种情况
珍惜时间,珍惜生命
8楼2013-07-05 14:59:07
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anna87

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-04-28 10:41:54
PCR,最重要的是引物。当然在其他条件大致没有什么问题的情况下。

菌液pcr引物怎么选择?是自己设计的引物  (加还是不加加酶切位点的),还是通用引物?谢谢
9楼2013-12-19 12:34:42
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小豆子J

铜虫 (初入文坛)

楼主,我遇到和你一样的情况,不过之前我菌液PCR有P出过东西,后来直至最近一直都没有P出过东西,我很郁闷,我提质粒双酶切后能切出自己想要的目的条带,送样测序也显示是正确的。请问你,最近你知道原因没,求支招
10楼2014-07-07 15:20:32
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