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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体后，菌液PCR，没有目的条带！！！
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slk8349

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建载体后，菌液PCR，没有目的条带！！！ 已有1人参与

我是从T载体上将目的片段用xbaⅠ，和hindⅢ直接双酶切，与我的载体pcmv连接，转化后，平板上菌落长得很好，可是做菌液PCR鉴定是，根本P不出来目的片段，请问是哪里有问题啊？看来好多的帖子，大家都说是不长菌落，可是我的菌落长的很好啊，而且我重复做了两次，结果都一样！我也做了酶切鉴定，xbaⅠ，和hindⅢ可以准确的从T载体上切下我的目的片段，而且，对PCMV也做了酶切，效果很好！求高人指点！！
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1楼 2013-04-27 23:38:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
slk8349(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助交流！ 2013-04-28 03:25:46
PCR用的引物在载体上还是在目的片段上？菌液PCR是否做了正负对照，确保PCR没有问题？转化时是否做了载体自连对照？此外，如果菌液PCR不成功的话，也可以提几个克隆的质粒做酶切鉴定。
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2楼2013-04-28 03:09:59
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wxf8470

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能是引物不好使，酶切鉴定无误后可以送去测序。
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3楼2013-04-28 10:20:12
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR，最重要的是引物。当然在其他条件大致没有什么问题的情况下。
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4楼2013-04-28 10:41:54
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senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果连接效率高的话，直接提取质粒酶切鉴定不就可以了！
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做实验就是和上帝玩游戏！
5楼2013-04-28 15:29:00
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mamjun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
slk8349(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-03 20:23:44
如果pcr用的是片段上两个引物的话，为什么要先酶切再连接呢，不可以直接pcr扩增目的片段再了解质粒吗=-O
pcr鉴定用引物是质粒上引物加片段上引物吗，是的话要考虑片段插入方向
楼主解决了吗，是什么原因？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2013-05-02 22:41:00
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shsDerek

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以酶切鉴定试试，如果没有的话，应该没有连进去
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7楼2013-05-03 11:04:16
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飞翔的麦穗

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可能被切得太散了，我之前也遇到过这种情况
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珍惜时间，珍惜生命
8楼2013-07-05 14:59:07
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anna87

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-04-28 10:41:54
PCR，最重要的是引物。当然在其他条件大致没有什么问题的情况下。

菌液pcr引物怎么选择？是自己设计的引物  （加还是不加加酶切位点的），还是通用引物？谢谢
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9楼2013-12-19 12:34:42
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小豆子J

铜虫 (初入文坛)
楼主，我遇到和你一样的情况，不过之前我菌液PCR有P出过东西，后来直至最近一直都没有P出过东西，我很郁闷，我提质粒双酶切后能切出自己想要的目的条带，送样测序也显示是正确的。请问你，最近你知道原因没，求支招
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10楼2014-07-07 15:20:32
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