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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR多条带，还能往后做双酶切吗
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fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR多条带，还能往后做双酶切吗

如题，我克隆之后的菌落PCR多条带，包含目的条带，请问往后做提质粒、双酶切、连接表达载体会不会有影响呀？本人第一次做，希望高手帮助，O(∩_∩)O谢谢！
图中右侧是我的其中一个基因，目的条带500多bp，就是最亮的那条。我是用自己设计的特异性引物进行PCR的。

2012-11-19 2+3_副本.jpg

[ Last edited by fayzhao on 2012-11-28 at 10:35 ]
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1楼 2012-11-28 10:33:02
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回帖置顶 ( 共有2个 )

fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2012-11-28 15:51:23
补充：我已经将菌液测序了，但是测序结果需要反向互补才是目的基因序列。这样对后续实验有没有影响呢？
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4楼2012-11-28 15:51:02
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fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2012-11-29 19:55:59
补充：今天用通用引物做了菌液PCR，结果是单条带，说明我的克隆没有问题。
由于PCR扩增时3‘端会加一个A，连接的时候也是随机的，就会导致测序结果与目的基因序列反向互补。
我自己连了一下序列试了试，理论上来说后面双酶切之后是没有影响的，但是不知道实际上是不是这样哦，希望有经验的高手帮忙一下啦
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17楼2012-11-29 19:52:26
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2012-11-28 15:41:30
可以，你酶切鉴定下，因为500bp相对来说比较小，用自己设计的引物很容易扩出来假阳性或者其他条带的，你酶切鉴定下，确定自己已经连上了，再做后续工作哈
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2楼2012-11-28 15:27:01
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-28 15:27:01
可以，你酶切鉴定下，因为500bp相对来说比较小，用自己设计的引物很容易扩出来假阳性或者其他条带的，你酶切鉴定下，确定自己已经连上了，再做后续工作哈

我拿菌液测序了，但是测出来的序列需要反向互补才是我的序列……这样的话对后面的实验有没有影响呢？
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3楼2012-11-28 15:43:26
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
fayzhao: 金币+1, 谢谢 2012-11-29 09:13:08
没有很理解，为啥要反向互补才是你的呢，不过在测序结果上做应该没什么问题，因为测序也都是机器操作，选择可信的测序公司比较关键

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-11-29 00:04:47
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助 2012-11-29 09:14:48
你的片段较小，一个测序反应即可测通了，所以没有特定要求的话，选择那一端测序是随即的。如果仅是做确认，后面实验不涉及载体上的序列（如酶切位点）的话，没有任何问题。
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6楼2012-11-29 04:34:28
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助 2012-11-29 09:17:57
反正你都有那么多阳性克隆了，有非特异性的就不用要了，否则到时双酶切还不知道会切成什么样
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7楼2012-11-29 04:58:24
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2012-11-29 09:19:34
多条带的直接扔掉，单挑带的保留可以后续试验
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8楼2012-11-29 08:57:27
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-29 00:04:47
没有很理解，为啥要反向互补才是你的呢，不过在测序结果上做应该没什么问题，因为测序也都是机器操作，选择可信的测序公司比较关键

我在擎科测序的，不知道为什么是这样的结果……
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9楼2012-11-29 09:12:40
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-11-29 04:34:28
你的片段较小，一个测序反应即可测通了，所以没有特定要求的话，选择那一端测序是随即的。如果仅是做确认，后面实验不涉及载体上的序列（如酶切位点）的话，没有任何问题。

我是自己加的酶切位点，双酶切的时候不用载体上的。我选择的是正向测序，那后面做表达有问题吗？
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10楼2012-11-29 09:14:32
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