应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR多条带，还能往后做双酶切吗
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
261/3返回列表123下一页
查看: 2601  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR多条带，还能往后做双酶切吗

如题，我克隆之后的菌落PCR多条带，包含目的条带，请问往后做提质粒、双酶切、连接表达载体会不会有影响呀？本人第一次做，希望高手帮助，O(∩_∩)O谢谢！
图中右侧是我的其中一个基因，目的条带500多bp，就是最亮的那条。我是用自己设计的特异性引物进行PCR的。

2012-11-19 2+3_副本.jpg

[ Last edited by fayzhao on 2012-11-28 at 10:35 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-11-28 10:33:02
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2012-11-28 15:51:23
补充：我已经将菌液测序了，但是测序结果需要反向互补才是目的基因序列。这样对后续实验有没有影响呢？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-28 15:51:02
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)
fayzhao: 回帖置顶 2012-11-29 19:55:59
补充：今天用通用引物做了菌液PCR，结果是单条带，说明我的克隆没有问题。
由于PCR扩增时3‘端会加一个A，连接的时候也是随机的，就会导致测序结果与目的基因序列反向互补。
我自己连了一下序列试了试，理论上来说后面双酶切之后是没有影响的，但是不知道实际上是不是这样哦，希望有经验的高手帮忙一下啦
赞一下 回复此楼
17楼2012-11-29 19:52:26
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2012-11-28 15:41:30
可以，你酶切鉴定下，因为500bp相对来说比较小，用自己设计的引物很容易扩出来假阳性或者其他条带的，你酶切鉴定下，确定自己已经连上了，再做后续工作哈
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-28 15:27:01
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-28 15:27:01
可以，你酶切鉴定下，因为500bp相对来说比较小，用自己设计的引物很容易扩出来假阳性或者其他条带的，你酶切鉴定下，确定自己已经连上了，再做后续工作哈

我拿菌液测序了，但是测出来的序列需要反向互补才是我的序列……这样的话对后面的实验有没有影响呢？
赞一下 回复此楼
3楼2012-11-28 15:43:26
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
fayzhao: 金币+1, 谢谢 2012-11-29 09:13:08
没有很理解，为啥要反向互补才是你的呢，不过在测序结果上做应该没什么问题，因为测序也都是机器操作，选择可信的测序公司比较关键

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-29 00:04:47
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助 2012-11-29 09:14:48
你的片段较小，一个测序反应即可测通了，所以没有特定要求的话，选择那一端测序是随即的。如果仅是做确认，后面实验不涉及载体上的序列（如酶切位点）的话，没有任何问题。
赞一下 回复此楼
6楼2012-11-29 04:34:28
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助 2012-11-29 09:17:57
反正你都有那么多阳性克隆了，有非特异性的就不用要了，否则到时双酶切还不知道会切成什么样
赞一下 回复此楼
7楼2012-11-29 04:58:24
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2012-11-29 09:19:34
多条带的直接扔掉，单挑带的保留可以后续试验
赞一下 回复此楼
8楼2012-11-29 08:57:27
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-29 00:04:47
没有很理解，为啥要反向互补才是你的呢，不过在测序结果上做应该没什么问题，因为测序也都是机器操作，选择可信的测序公司比较关键

我在擎科测序的，不知道为什么是这样的结果……
赞一下 回复此楼
9楼2012-11-29 09:12:40
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-11-29 04:34:28
你的片段较小，一个测序反应即可测通了，所以没有特定要求的话，选择那一端测序是随即的。如果仅是做确认，后面实验不涉及载体上的序列（如酶切位点）的话，没有任何问题。

我是自己加的酶切位点，双酶切的时候不用载体上的。我选择的是正向测序，那后面做表达有问题吗？
赞一下 回复此楼
10楼2012-11-29 09:14:32
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fayzhao 的主题更新
261/3返回列表123下一页
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 332求调剂 +17 小小孟... 2026-04-05 18/900 2026-04-06 09:51 by 蓝云思雨
[考研] 085600，320分求调剂 +16 大馋小子 2026-04-04 17/850 2026-04-06 07:58 by MOF_Catal
[考研] 0703求调剂383分 +9 W55j 2026-04-03 9/450 2026-04-06 06:50 by houyaoxu
[考研] 调剂 +5 好好读书。 2026-04-01 5/250 2026-04-05 17:54 by liucky
[考研] 材料调剂 +7 dxy调剂 2026-04-04 7/350 2026-04-05 09:15 by 陌秋26
[考研] 专硕310求调剂 +5 捞捞我…. 2026-04-04 6/300 2026-04-04 23:33 by barlinike
[考研] 283分材料与化工求调剂 +29 罗KAKA 2026-04-02 29/1450 2026-04-03 23:56 by userper
[考研] 322求调剂 +6 FZAC123 2026-04-03 6/300 2026-04-03 22:23 by 科研小专家
[考研] 266求调剂 +18 阳阳哇塞 2026-04-01 18/900 2026-04-03 18:38 by zllcz
[考研] 求调剂 +3 心想事成可 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:22 by wangjy2002
[考研] 319求调剂 +18 太容易1018 2026-04-01 18/900 2026-04-03 11:18 by linyelide
[考研] 312求调剂 +6 小小墨123 2026-04-02 7/350 2026-04-03 07:32 by jsw79
[考研] 0856材料与化工调剂，339 +14 10213207 2026-03-31 14/700 2026-04-02 21:01 by 1104338198
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +8 cs0106 2026-04-01 9/450 2026-04-02 10:36 by 不吃魚的貓
[考研] 279求调剂 +6 学而思兮知 2026-04-01 6/300 2026-04-02 09:16 by vgtyfty
[考博] 26年申博 +3 staryer 2026-03-30 4/200 2026-04-01 23:21 by ai4pharm
[考研] 08工科，295，接受跨专业调剂 +6 lmnlzy 2026-03-31 6/300 2026-04-01 11:02 by 逆水乘风
[考研] 318求调剂 +8 七忆77 2026-04-01 8/400 2026-04-01 10:37 by Jaylen.
[考研] 【调剂】一志愿厦大生物与医药调剂 +3 Echo虾米 2026-03-31 3/150 2026-04-01 08:40 by JourneyLucky
[考研] 070300化学专业279调剂 +10 哈哈哈^_^ 2026-03-31 10/500 2026-03-31 23:13 by liu823948201
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭