24小时热门版块排行榜    

查看: 2908  |  回复: 25

fayzhao

金虫 (小有名气)

[求助] 菌落PCR多条带,还能往后做双酶切吗

如题,我克隆之后的菌落PCR多条带,包含目的条带,请问往后做提质粒、双酶切、连接表达载体会不会有影响呀?本人第一次做,希望高手帮助,O(∩_∩)O谢谢!
图中右侧是我的其中一个基因,目的条带500多bp,就是最亮的那条。我是用自己设计的特异性引物进行PCR的。

2012-11-19 2+3_副本.jpg

[ Last edited by fayzhao on 2012-11-28 at 10:35 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

fayzhao

金虫 (小有名气)

fayzhao: 回帖置顶 2012-11-28 15:51:23
补充:我已经将菌液测序了,但是测序结果需要反向互补才是目的基因序列。这样对后续实验有没有影响呢?
4楼2012-11-28 15:51:02
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)

fayzhao: 回帖置顶 2012-11-29 19:55:59
补充:今天用通用引物做了菌液PCR,结果是单条带,说明我的克隆没有问题。
由于PCR扩增时3‘端会加一个A,连接的时候也是随机的,就会导致测序结果与目的基因序列反向互补。
我自己连了一下序列试了试,理论上来说后面双酶切之后是没有影响的,但是不知道实际上是不是这样哦,希望有经验的高手帮忙一下啦
17楼2012-11-29 19:52:26
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, 有帮助, 谢谢 2012-11-28 15:41:30
可以,你酶切鉴定下,因为500bp相对来说比较小,用自己设计的引物很容易扩出来假阳性或者其他条带的,你酶切鉴定下,确定自己已经连上了,再做后续工作哈
2楼2012-11-28 15:27:01
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-28 15:27:01
可以,你酶切鉴定下,因为500bp相对来说比较小,用自己设计的引物很容易扩出来假阳性或者其他条带的,你酶切鉴定下,确定自己已经连上了,再做后续工作哈

我拿菌液测序了,但是测出来的序列需要反向互补才是我的序列……这样的话对后面的实验有没有影响呢?
3楼2012-11-28 15:43:26
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


fayzhao: 金币+1, 谢谢 2012-11-29 09:13:08
没有很理解,为啥要反向互补才是你的呢,不过在测序结果上做应该没什么问题,因为测序也都是机器操作,选择可信的测序公司比较关键

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2012-11-29 00:04:47
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, 有帮助 2012-11-29 09:14:48
你的片段较小,一个测序反应即可测通了,所以没有特定要求的话,选择那一端测序是随即的。如果仅是做确认,后面实验不涉及载体上的序列(如酶切位点)的话,没有任何问题。
6楼2012-11-29 04:34:28
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, 有帮助 2012-11-29 09:17:57
反正你都有那么多阳性克隆了,有非特异性的就不用要了,否则到时双酶切还不知道会切成什么样
7楼2012-11-29 04:58:24
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fayzhao: 金币+1 2012-11-29 09:19:34
多条带的直接扔掉,单挑带的保留可以后续试验
8楼2012-11-29 08:57:27
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-29 00:04:47
没有很理解,为啥要反向互补才是你的呢,不过在测序结果上做应该没什么问题,因为测序也都是机器操作,选择可信的测序公司比较关键

我在擎科测序的,不知道为什么是这样的结果……
9楼2012-11-29 09:12:40
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fayzhao

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-11-29 04:34:28
你的片段较小,一个测序反应即可测通了,所以没有特定要求的话,选择那一端测序是随即的。如果仅是做确认,后面实验不涉及载体上的序列(如酶切位点)的话,没有任何问题。

我是自己加的酶切位点,双酶切的时候不用载体上的。我选择的是正向测序,那后面做表达有问题吗?
10楼2012-11-29 09:14:32
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 fayzhao 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 基金未中,这种答复是模板吗? +4 zhaosm1982 2026-08-27 5/250 2026-08-27 12:17 by zhaosm1982
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 面上合作单位盖章 +3 ssyjh 2026-08-27 3/150 2026-08-27 09:59 by 阿拉贡aragon
[基金申请] 让我中一个面上吧! +13 大萍1987 2026-08-20 17/850 2026-08-27 08:20 by 大萍1987
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 +7 晴天加油 2026-08-26 8/400 2026-08-27 07:53 by longfie172
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 LIbGuocjEEYw 2026-08-26 4/200 2026-08-27 04:33 by Ie9AyIAvGbvs
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国合现在查不到了吗? +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
请填处理意见