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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化后菌落pcr有目的条带，小摇长菌，再大摇不长了，求帮助~
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

[求助] 转化后菌落pcr有目的条带，小摇长菌，再大摇不长了，求帮助~

各位虫友，我最近做了两批农杆菌转化，挑单菌落小摇后做菌液PCR，有目的条带，接着就开始大摇，大概20-30ml加2-3菌液，做了六瓶，一点都没长，没找到原因，接着我又挑了一次菌落，又小摇浑浊，做了菌液PCR，有目的条带，再继续大摇，还是一点都没长，很是让我悲伤，不知道问题出现在哪地方了。。。。。。我每次的培养基都是YEB，且加的抗生素都一致，不过我小摇后的菌是放在四度冰箱做完菌液PCR后大摇的，这有影响吗？找不到原因了，是感受态做的不好吗，还是其他的原因。。。。。。求帮助
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坚持就是胜利
1楼2012-08-25 13:27:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-25 19:47:16
王艳xinwei: 金币+3 2012-09-13 12:49:09
20-30ml加2-3（ul? ml?）。
个人觉得，你的做法有点问题。挑取单菌落后（可以用1.5ml离心管），用例如10ul水溶解稀释，取1ul作为模板做菌落PCR，剩余的9ul加入培养基及抗生素在PCR过程时就开始37度摇菌，等你的PCR完成后跑胶检测时，你的菌液浓度也差不多了。根据PCR结果选择需要扩大培养的菌，把这1管（可能你加LB是1ml开始）全部加到20ml培养基里，这样就容易获得你需要的了，而且时间也不会摇的太久。
你的做法是挑取后放在4度冰箱，这样，菌几乎不长，如果你又加了LB培养基（具体不知道你加了多少），如果你加的是1ML, 那么如果你只是吸取其中的一部分扩大培养，很有可能就没吸到或者量太少，因为你最开始的菌是溶解在这1ML培养基里的，或者你的菌还在培养基底部如果你开始加了LB后没有混匀的话。
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3楼2012-08-25 14:57:08
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种问题我以前遇到过，大摇时菌液加的太少了，你可以加个几百ul试试
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生物化学与分子生物学
5楼2012-08-27 10:22:31
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irenescbg

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-28 13:53:04
农杆菌转化，有的时候会有污染，我想问一下你的小体积菌液的浓度是否正常，味道是否正常。另外，做PCR的时候没有必要把菌液放4度啊，继续摇就好了。前面有个人说得很对，多加点菌液会好的。我一般都是1:100稀释，摇大体积都没问题的。
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请赐予我正能量吧！加油！
6楼2012-08-27 16:09:47
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tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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王艳xinwei: 金币+3 2012-09-13 12:49:45
会不会是假阳性啊，我们一般要要两次在酶切才算检测成功了。有时候第一次能长菌，PCR结果也不错，但是再次摇菌就没有东西了，我们判断为假阳性
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8楼2012-08-28 13:20:18
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peitaokong

银虫 (小有名气)
一般小摇后，用甘油和菌种以1:1的比例混匀，保存后置于-80度冰箱里。在-4度的冰箱几个小时还行，时间长了，会影响菌种的活性的。
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9楼2012-08-29 08:01:27
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peitaokong

银虫 (小有名气)
应该问题出在保存菌种时的方法欠妥。你如果小摇后，立即大摇，如果仍旧摇不起来，则可能是其他的问题。如果立即大摇能摇起来，就是你的保存菌种的方法欠妥。
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10楼2012-08-29 08:05:44
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

接种量太少。。这个问题我师弟遇到过，那会刚开始做实验，50ml培养基接10ul种子 ，恁是一点没长。~~
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
12楼2012-08-29 17:13:41
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
王艳xinwei: 金币+3 2012-09-13 12:50:43
你按1%或者更大的接种量试试看。
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
13楼2012-08-29 17:14:12
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强子kycg

新虫 (小有名气)
我做的事大肠杆菌  转化后可以检测出目的条带   可是大瑶的时候总是摇不起来   求高手支招
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14楼2013-05-08 09:55:25
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普通回帖

zhoucb
2楼2012-08-25 14:11:43
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-25 14:57:08
20-30ml加2-3（ul? ml?）。
个人觉得，你的做法有点问题。挑取单菌落后（可以用1.5ml离心管），用例如10ul水溶解稀释，取1ul作为模板做菌落PCR，剩余的9ul加入培养基及抗生素在PCR过程时就开始37度摇菌，等你的PCR ...

谢谢，估计有可能是放4度影响了菌的生长
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坚持就是胜利
4楼2012-08-26 20:55:53
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by irenescbg at 2012-08-27 16:09:47
农杆菌转化，有的时候会有污染，我想问一下你的小体积菌液的浓度是否正常，味道是否正常。另外，做PCR的时候没有必要把菌液放4度啊，继续摇就好了。前面有个人说得很对，多加点菌液会好的。我一般都是1:100稀释，摇 ...

谢谢
应该没有污染，我都有做重复，而且每个小摇都长起来了，量应该不少了，最后我将我小摇的将近5ml都加入了30ml液体培养基了，还是没摇起来，难道是菌活力不够？
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坚持就是胜利
7楼2012-08-28 11:21:27
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