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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

[求助] 转化后菌落pcr有目的条带,小摇长菌,再大摇不长了,求帮助~

各位虫友,我最近做了两批农杆菌转化,挑单菌落小摇后做菌液PCR,有目的条带,接着就开始大摇,大概20-30ml加2-3菌液,做了六瓶,一点都没长,没找到原因,接着我又挑了一次菌落,又小摇浑浊,做了菌液PCR,有目的条带,再继续大摇,还是一点都没长,很是让我悲伤,不知道问题出现在哪地方了。。。。。。我每次的培养基都是YEB,且加的抗生素都一致,不过我小摇后的菌是放在四度冰箱做完菌液PCR后大摇的,这有影响吗?找不到原因了,是感受态做的不好吗,还是其他的原因。。。。。。求帮助
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坚持就是胜利
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-25 14:57:08
20-30ml加2-3(ul? ml?)。
个人觉得,你的做法有点问题。挑取单菌落后(可以用1.5ml离心管),用例如10ul水溶解稀释,取1ul作为模板做菌落PCR,剩余的9ul加入培养基及抗生素在PCR过程时就开始37度摇菌,等你的PCR ...

谢谢,估计有可能是放4度影响了菌的生长
坚持就是胜利
4楼2012-08-26 20:55:53
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by irenescbg at 2012-08-27 16:09:47
农杆菌转化,有的时候会有污染,我想问一下你的小体积菌液的浓度是否正常,味道是否正常。另外,做PCR的时候没有必要把菌液放4度啊,继续摇就好了。前面有个人说得很对,多加点菌液会好的。我一般都是1:100稀释,摇 ...

谢谢
应该没有污染,我都有做重复,而且每个小摇都长起来了,量应该不少了,最后我将我小摇的将近5ml都加入了30ml液体培养基了,还是没摇起来,难道是菌活力不够?
坚持就是胜利
7楼2012-08-28 11:21:27
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by tanglian8655 at 2012-08-28 13:20:18
会不会是假阳性啊,我们一般要要两次在酶切才算检测成功了。有时候第一次能长菌,PCR结果也不错,但是再次摇菌就没有东西了,我们判断为假阳性

11楼2012-08-29 15:21:06
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