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王艳xinwei银虫 (小有名气)
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[求助]
转化后菌落pcr有目的条带，小摇长菌，再大摇不长了，求帮助~
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| 各位虫友，我最近做了两批农杆菌转化，挑单菌落小摇后做菌液PCR，有目的条带，接着就开始大摇，大概20-30ml加2-3菌液，做了六瓶，一点都没长，没找到原因，接着我又挑了一次菌落，又小摇浑浊，做了菌液PCR，有目的条带，再继续大摇，还是一点都没长，很是让我悲伤，不知道问题出现在哪地方了。。。。。。我每次的培养基都是YEB，且加的抗生素都一致，不过我小摇后的菌是放在四度冰箱做完菌液PCR后大摇的，这有影响吗？找不到原因了，是感受态做的不好吗，还是其他的原因。。。。。。求帮助 |
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【答案】应助回帖
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王艳xinwei: 金币+3 2012-09-13 12:49:09
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王艳xinwei: 金币+3 2012-09-13 12:49:09
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20-30ml加2-3（ul? ml?）。 个人觉得，你的做法有点问题。挑取单菌落后（可以用1.5ml离心管），用例如10ul水溶解稀释，取1ul作为模板做菌落PCR，剩余的9ul加入培养基及抗生素在PCR过程时就开始37度摇菌，等你的PCR完成后跑胶检测时，你的菌液浓度也差不多了。根据PCR结果选择需要扩大培养的菌，把这1管（可能你加LB是1ml开始）全部加到20ml培养基里，这样就容易获得你需要的了，而且时间也不会摇的太久。 你的做法是挑取后放在4度冰箱，这样，菌几乎不长，如果你又加了LB培养基（具体不知道你加了多少），如果你加的是1ML, 那么如果你只是吸取其中的一部分扩大培养，很有可能就没吸到或者量太少，因为你最开始的菌是溶解在这1ML培养基里的，或者你的菌还在培养基底部如果你开始加了LB后没有混匀的话。 |
3楼2012-08-25 14:57:08
王艳xinwei
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