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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR多条带，还能往后做双酶切吗
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-29 19:57:35
呵呵，做出来就好~恭喜一下哈~

O(∩_∩)O谢谢！
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21楼2012-11-29 19:59:53
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+1, ★有帮助, O(∩_∩)O谢谢 2012-11-30 17:28:06
个人感觉没问题，一般的酶切位点正反都是一样的，对酶切应该没有啥影响！
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22楼2012-11-29 22:12:17
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天空2011

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by fayzhao at 2012-11-29 19:52:26
补充：今天用通用引物做了菌液PCR，结果是单条带，说明我的克隆没有问题。
由于PCR扩增时3‘端会加一个A，连接的时候也是随机的，就会导致测序结果与目的基因序列反向互补。
我自己连了一下序列试了试，理论上来说 ...

感觉楼主挺明白的，没必要在这个问题上太纠结
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23楼2012-11-29 22:15:09
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
fayzhao: 金币+1, ★有帮助, O(∩_∩)O谢谢 2012-11-30 17:29:29
PCR片段AT克隆方向是随即的，如果有所加酶切位点，已经确定了方向，切下目的片段用于表达是没有问题。
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24楼2012-11-30 04:40:06
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fayzhao: 金币+2, ★有帮助 2012-11-30 17:42:39
我觉着楼主可能发错测序引物了，才导致每次测出来的都是反向，具体可以把另一份引物发出去，让他测一个看看会不会是正向结果。
不过，不管正反，只要连到载体上不影响目的基因的表达——具体看嘛就是正向那头是不是紧邻启动子。
不过PCR，P出多片段一定不要轻易进行下一步实验，道理很简单，分子实验本来就问题多多困难重重，万一出错可能要回溯好几个步骤寻找纰缪，所以尽可能保证每一步的规范、准确。这才是分子实验的重中之重。
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25楼2012-11-30 11:06:10
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fayzhao

金虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-30 11:06:10
我觉着楼主可能发错测序引物了，才导致每次测出来的都是反向，具体可以把另一份引物发出去，让他测一个看看会不会是正向结果。
不过，不管正反，只要连到载体上不影响目的基因的表达——具体看嘛就是正向那头是不是 ...

引物是用的通用引物，没有自己送引物过去。
我后面通用引物做的菌液PCR是单条带了，这个没问题了。只要连接反向没有问题就行了
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26楼2012-11-30 17:42:28
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