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asdkingstar

金虫 (正式写手)

[求助] 16SrRNA(1540bp)全长菌落PCR后进行检测得到的条带基本上都接近2000bp,这是为什么?

本人刚刚接触这方面内容,对于很多东西还是处于幼儿园状态,求各位大神帮助指导。在此表示深深的感谢!
       本人刚刚做到菌落PCR这块,做完后进行双酶切,然后测序。可是做到这里发现了问题,本人做的是16SrRNA全长菌落PCR,经琼脂糖检测,得到条带基本上都快接近200bp了,理论上应该不会超过1700bp才对,求大神指点迷津。以下是检测图。用的是D2000的mark。

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elbo

金虫 (小有名气)

你在做连接转化的时候应该做个阳性对照,另外菌落PCR的时候也应该做个阴性对照
2楼2012-09-05 11:47:49
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by elbo at 2012-09-05 11:47:49
你在做连接转化的时候应该做个阳性对照,另外菌落PCR的时候也应该做个阴性对照

谢谢!我是初学者,这个做个对照就能知道我所得到的条带(上图中)是不是目的条带(理论上不超过1700bp)?
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3楼2012-09-05 16:52:59
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yanjing27

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这个我做了好久了,PCR出现特异性条带我也遇到过,你换个PCR仪或者把试剂都换新的做,我扩的1500左右,用DL2000,这个很容易扩的
4楼2012-09-05 21:03:16
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elbo

金虫 (小有名气)

把你PCR条件贴出来,另外换做菌液PCR吧,引物二聚体多的很
5楼2012-09-06 10:33:08
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

PCR:94℃   5min   ,  94℃   30s  ,55℃   30s,72℃  30s  ,  72℃   10min。(30cyl)
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6楼2012-09-06 17:48:16
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zrg1989

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你用的是什么引物?是质粒上的引物还是16S rRNA基因上的引物?如果是先把16S rRNA基因连到载体上再转化再菌落PCR验证的话,PCR产物全长应该是16S rRNA基因再加上载体上的部分片段,看你是怎么做的了
7楼2012-11-03 18:43:01
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zrg1989 at 2012-11-03 18:43:01
你用的是什么引物?是质粒上的引物还是16S rRNA基因上的引物?如果是先把16S rRNA基因连到载体上再转化再菌落PCR验证的话,PCR产物全长应该是16S rRNA基因再加上载体上的部分片段,看你是怎么做的了

谢谢,你说的很对,我应经知道了,谢谢。
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8楼2012-11-03 20:54:21
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zrg1989

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by asdkingstar at 2012-11-03 20:54:21
谢谢,你说的很对,我应经知道了,谢谢。...

晕,我才反应过来你把胶图片给放反了
9楼2012-11-03 21:52:07
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asdkingstar

金虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by zrg1989 at 2012-11-03 21:52:07
晕,我才反应过来你把胶图片给放反了...

呵呵。这你都能说对?厉害
爱是浅浅的喜欢,喜欢是浅浅的爱。
10楼2012-11-04 10:17:53
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