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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 目的片段+pPIC9K载体转化大肠杆菌DH5a后提取质粒失败
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沧海一声笑7

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段+pPIC9K载体转化大肠杆菌DH5a后提取质粒失败

我是要做转化毕赤酵母的，然而目的片段(1.5kb)与pPIC9K（9.3kb）连接后转化DH5a，菌液PCR有条带，可是提取质粒后跑电泳就出现两条带，一条是在10000多那里，另外一天在3000-4000那里，而且下面那条更亮。请问是为什么呀？都做了好几次了。请指教！
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1楼 2012-10-22 12:34:46
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+4, 谢谢热心交流~ :) 2012-10-22 13:04:45
所提质粒有三种形式，超螺旋、开环和线状。如果质粒提得好，应该绝大部分是超螺旋的。超螺旋质粒跑得比线性分子快。你的marker是线性的。所以10K的质粒跑到4Kmarker附近是有可能的。如果想确定质粒大小，做个简单的单酶切就可以和marker分子量对比了。
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2楼2012-10-22 13:03:23
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普通回帖

沧海一声笑7

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-22 13:03:23
所提质粒有三种形式，超螺旋、开环和线状。如果质粒提得好，应该绝大部分是超螺旋的。超螺旋质粒跑得比线性分子快。你的marker是线性的。所以10K的质粒跑到4Kmarker附近是有可能的。如果想确定质粒大小，做个简单的 ...

有做过双酶切，结果大小不符合。酶切后有两条带，一条是目的片段那么大，课另外一条是在2000-3000那里。哎！！！！
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3楼2012-10-22 14:22:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 沧海一声笑7 at 2012-10-22 14:22:40
有做过双酶切，结果大小不符合。酶切后有两条带，一条是目的片段那么大，课另外一条是在2000-3000那里。哎！！！！...

很可能是质粒不对了，重新做连接吧。
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4楼2012-10-23 07:39:46
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沧海一声笑7

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-23 07:39:46
很可能是质粒不对了，重新做连接吧。...

有重新做过三次了，都一样，重新从19T质粒中双酶切后胶回收，重新做感受，再重新连接，都是一样的结果。哎。。。。
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5楼2012-10-23 21:07:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 沧海一声笑7 at 2012-10-23 21:07:44
有重新做过三次了，都一样，重新从19T质粒中双酶切后胶回收，重新做感受，再重新连接，都是一样的结果。哎。。。。...

你切胶回收酶切产物是时候大小是对的吧。你是说连完后质粒大小就不对了？你用单酶切下质粒看大小是多少？传个图看看更明白一点。
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6楼2012-10-24 06:28:50
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匿名

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7楼2013-06-27 18:41:34
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mao081312

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 328771722 at 2013-06-27 18:41:34
为什么我用EcoRI和NotI双酶切Ppic9k，1kMarker，条带却在10000偏上一点，做了好多次，提质粒，还是这种情况，为什么??

我也是这样的……不知道楼主有没有弄明白这个问题，求教
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8楼2013-11-18 19:19:40
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匿名

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9楼2013-11-19 12:25:34
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wei_2008

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感觉大小像是连接的T载体啊
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10楼2013-11-19 12:50:53
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