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沧海一声笑7

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段+pPIC9K载体转化大肠杆菌DH5a后提取质粒失败

我是要做转化毕赤酵母的,然而目的片段(1.5kb)与pPIC9K(9.3kb)连接后转化DH5a,菌液PCR有条带,可是提取质粒后跑电泳就出现两条带,一条是在10000多那里,另外一天在3000-4000那里,而且下面那条更亮。请问是为什么呀?都做了好几次了。请指教!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 沧海一声笑7 at 2012-10-22 14:22:40
有做过双酶切,结果大小不符合。酶切后有两条带,一条是目的片段那么大,课另外一条是在2000-3000那里。哎!!!!...

很可能是质粒不对了,重新做连接吧。
4楼2012-10-23 07:39:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
scelab: 金币+4, 谢谢热心交流~ :) 2012-10-22 13:04:45
所提质粒有三种形式,超螺旋、开环和线状。如果质粒提得好,应该绝大部分是超螺旋的。超螺旋质粒跑得比线性分子快。你的marker是线性的。所以10K的质粒跑到4Kmarker附近是有可能的。如果想确定质粒大小,做个简单的单酶切就可以和marker分子量对比了。
2楼2012-10-22 13:03:23
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沧海一声笑7

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-22 13:03:23
所提质粒有三种形式,超螺旋、开环和线状。如果质粒提得好,应该绝大部分是超螺旋的。超螺旋质粒跑得比线性分子快。你的marker是线性的。所以10K的质粒跑到4Kmarker附近是有可能的。如果想确定质粒大小,做个简单的 ...

有做过双酶切,结果大小不符合。酶切后有两条带,一条是目的片段那么大,课另外一条是在2000-3000那里。哎!!!!
3楼2012-10-22 14:22:40
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沧海一声笑7

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-23 07:39:46
很可能是质粒不对了,重新做连接吧。...

有重新做过三次了,都一样,重新从19T质粒中双酶切后胶回收,重新做感受,再重新连接,都是一样的结果。哎。。。。
5楼2012-10-23 21:07:44
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