| 查看: 1292 | 回复: 4 | |||
[交流]
【求助/交流】有关克隆方面的问题 已有4人参与
|
|
本人在做两个基因的克隆，使用Takara的EXtaq扩增出了DNA全长，分别为1800bp和3000bp左右，使用pMD18-T载体做T-A克隆。 1800bp左右的菌液PCR得到了和我目的条带一致的条带，送样测序结果找不到引物，经过BLAST比对后发现根本不是我要的目的条带，很困惑，为什么测序的结果找不到引物呢，是不是因为没连接上。或者是我根本就没扩出目的条带？可是测序结果总要找到引物啊。我的连接体系是1μl载体，4μlDNA, 5μl SoulutionⅠ，16℃连接了1天，按道理来说1800bp左右的片段连接过夜就可以了，为什么1天了也连接不上啊。 另外想问一下3000bp的片段takara的载体不是很好连啊，我都做了2次了，都是没有结果，郁闷死了，哪位高手能提供点意见啊。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有98人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 克隆过程出现的问题
已经有7人回复
- 关于Kan板克隆的问题
已经有5人回复
- 一个关于水稻基因图位克隆的问题诚挚恳求大牛解答
已经有35人回复
- 分子克隆连接问题！
已经有12人回复
- 关于多克隆抗体制备的有关问题
已经有4人回复
- 与16S克隆文库有关的问题
已经有3人回复
- 基因克隆问题~~
已经有5人回复
- 【求助/交流】关于分子克隆的技术问题，很纠结！
已经有7人回复
- 【求助/交流】关于基因克隆写文章的问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】有关蛋白纯化及其基因克隆的问题！请大家帮助！
已经有10人回复
- 【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案
已经有17人回复
- 【求助/交流】关于PCR克隆片段连接问题
已经有4人回复
2楼2010-11-03 23:27:13
sai00fuji
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1049.4
- 散金: 673
- 红花: 3
- 帖子: 504
- 在线: 130.4小时
- 虫号: 470099
- 注册: 2007-11-29
- 专业: 生物化学
3楼2010-11-04 14:52:24
playboy723
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 783.3
- 帖子: 352
- 在线: 43.3小时
- 虫号: 344753
- 注册: 2007-04-14
- 性别: GG
- 专业: 遗传学和分子生物学
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):good 2010-11-04 18:30:35
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):good 2010-11-04 18:30:35
|
发表下看法： 1、不建议用EXtaq，这个酶扩短点儿的片段还行，1000bp以上就会出现很多错配了，即使连上了也没法用，找个pfu系列的高保真酶扩吧，我用takara公司的primerstar酶扩3000bp没有错配或缺失，建议你用这个 2、1800bp连T载体效率已经很低了，3000bp连的话基本靠运气，成功率极低，不过你可以不断的试，直到连上为止。建议你分成2段来扩，分别连到T载体上，测序成功后再连到一起，这样把握大些。 3、PCR时退火温度高些较好，没有非特异的杂带，另外操作时尽量要严谨，避免出现不明的现象。 |
4楼2010-11-04 15:44:21
friend.11
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 429
- 散金: 811
- 帖子: 653
- 在线: 120.6小时
- 虫号: 590424
- 注册: 2008-08-31
- 专业: 分析仪器与试剂
5楼2010-11-04 19:33:09
