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本人在做两个基因的克隆，使用Takara的EXtaq扩增出了DNA全长，分别为1800bp和3000bp左右，使用pMD18-T载体做T-A克隆。 1800bp左右的菌液PCR得到了和我目的条带一致的条带，送样测序结果找不到引物，经过BLAST比对后发现根本不是我要的目的条带，很困惑，为什么测序的结果找不到引物呢，是不是因为没连接上。或者是我根本就没扩出目的条带？可是测序结果总要找到引物啊。我的连接体系是1μl载体，4μlDNA, 5μl SoulutionⅠ，16℃连接了1天，按道理来说1800bp左右的片段连接过夜就可以了，为什么1天了也连接不上啊。 另外想问一下3000bp的片段takara的载体不是很好连啊，我都做了2次了，都是没有结果，郁闷死了，哪位高手能提供点意见啊。 |
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sai00fuji
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3):good 2010-11-04 18:30:35
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dhd997(金币+3):good 2010-11-04 18:30:35
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发表下看法： 1、不建议用EXtaq，这个酶扩短点儿的片段还行，1000bp以上就会出现很多错配了，即使连上了也没法用，找个pfu系列的高保真酶扩吧，我用takara公司的primerstar酶扩3000bp没有错配或缺失，建议你用这个 2、1800bp连T载体效率已经很低了，3000bp连的话基本靠运气，成功率极低，不过你可以不断的试，直到连上为止。建议你分成2段来扩，分别连到T载体上，测序成功后再连到一起，这样把握大些。 3、PCR时退火温度高些较好，没有非特异的杂带，另外操作时尽量要严谨，避免出现不明的现象。 |
4楼2010-11-04 15:44:21
friend.11
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5楼2010-11-04 19:33:09