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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆过程出现的问题
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 克隆过程出现的问题

目的片段连接TA载体，转化后平板挑单克隆菌落PCR鉴定，摇菌分装，一管测序，一管提质粒PCR，结果却不一样，测序结果是单一的，PCR结果不单一，请教原因。PCR和测序过程不一样吗？
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1楼 2011-11-14 11:26:58
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 同意！ 2011-11-14 16:21:15
楼主摇菌时会不会污染，再有菌落PCR假阳性很高，楼主可以酶切验证一下，
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jiayoubashaonian
2楼2011-11-14 11:50:13
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liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 谢谢！ 2011-11-15 11:36:23
连T载体，一般很容易的。
保险起见，单菌落PCR之后还是提质粒酶切一下再测序。
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3楼2011-11-14 15:06:04
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
还有种情况，就是公司把样弄错了！
我们以前送小麦的BAC，结果出来的是水稻的，后来他们帮我们重新测！
不点名该公司！
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真相是最大的奢侈品
4楼2011-11-14 16:22:39
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dnaxxx

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

笔冰河(金币+1): 谢谢！ 2011-11-15 11:33:48
肯定有可能的，测序公司的引物一般是通用引物，特异性很好，而你用的引物条件可能没有调到最好，所以出现非特异带，不过只要有目的片段大小的条带出现，酶切鉴定又没问题得话没什么大碍
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5楼2011-11-15 06:59:01
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果测序结果对得上的话就应该以测序结果为依据。PCR的稳定性要差一些，尤其是菌体PCR。如果还不放心就小提后做下酶切验证吧。
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摒气动方息，宁神心自明。
6楼2011-11-15 08:19:54
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dnaxxx at 2011-11-15 06:59:01:
肯定有可能的，测序公司的引物一般是通用引物，特异性很好，而你用的引物条件可能没有调到最好，所以出现非特异带，不过只要有目的片段大小的条带出现，酶切鉴定又没问题得话没什么大碍

但是非特异带后来测序发现也是来自最开始的基因组的不同基因，所以应该最开始就P出来了，为什么测序只测出一个基因，而同一管菌提质粒PCR后却多个条带？
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7楼2011-11-15 11:33:13
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-14 11:50:13:
楼主摇菌时会不会污染，再有菌落PCR假阳性很高，楼主可以酶切验证一下，

酶切鉴定过，没问题，因为几条带只差几十bp，可能有多条带看不出来
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8楼2011-11-15 11:34:57
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