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brightjoe至尊木虫 (职业作家)
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[交流]
【求助/交流】克隆测序问题 已有1人参与
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| 最近做基因表达，挑克隆测序在引物的位置（酶切位点附近）总是少一个核苷酸。实验重复了好几遍，自己怀疑是引物不纯，换了家公司合成引物还是出现同样的问题。引物采用的是page纯化，难道纯度不够吗？或者是载体有问题，还是感受态菌复制系统出了问题，想不明白？望达人不吝赐教。实验重复了五六遍了。。。。诶 |
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2楼2010-10-12 12:41:08
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brightjoe(金币+10):谢谢赐教，谢谢赐教！确实是缺失不同的碱基，不过同一个样品还没有测过两次，那测序图谱是好的能说明测序结果没问题吗？ 2010-10-12 15:07:10
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你说的“缺失在引物上”是在插入片段的引物上么？ 如果是的话，和载体没什么关系吧 用同一个克隆测多个反应，结果里面缺失的位置相同么？如果相同，说明确实存在这样一个缺失，可能确实是引物的问题；如果不同，则可能是测序的问题，比如这里的序列比较特殊，或者连接位点附近，载体序列和片段序列恰好形成某种结构，导致测序酶在这里发生slip，或者测序信号在这里发生压缩错位，这都有可能的，尤其是在每次缺失的位置都不一样，无法得到一个稳定结果的情况下。 |
5楼2010-10-12 13:55:54
brightjoe
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