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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序的问题
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 测序的问题 已有5人参与

想请教一下大家一般测序公司的准确率是多少啊？需要测重复吗？
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1楼 2011-07-06 13:37:29
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+1): 叠峰 最闹心 2011-07-06 14:14:06
测出来是你要的话不用的，测一次就够了。如果出现层叠峰、无信号等情况可以考虑重新送样测序。
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2楼2011-07-06 13:59:15
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by lxj341401 at 2011-07-06 13:59:15:
测出来是你要的话不用的，测一次就够了。如果出现层叠峰、无信号等情况可以考虑重新送样测序。

我克一个基因，挑了三个单克隆测序，可是结果都不一样，但是差得不多，所以在想会不会是测序的问题，但是看峰图都挺好的呀！难道我的基因是多拷贝？
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3楼2011-07-06 14:42:15
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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西瓜(金币+3): good 2011-07-06 17:02:26
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Originally posted by friya0910 at 2011-07-06 14:42:15:
我克一个基因，挑了三个单克隆测序，可是结果都不一样，但是差得不多，所以在想会不会是测序的问题，但是看峰图都挺好的呀！难道我的基因是多拷贝？

应该不是测序的问题，现在测序结果还是比较可信的。三个单克隆三个不同结果也可以理解，基因应该是单拷贝的，都连进去了，但连的是不同的基因，是前面实验的问题。三个里面如果有一个是你要的，就挑取那个单克隆，其他两个单克隆都不要了，继续后面实验，如果都不是你要的，就挑别的单克隆去测序了或者重新转化了。
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4楼2011-07-06 15:17:20
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by lxj341401 at 2011-07-06 15:17:20:
应该不是测序的问题，现在测序结果还是比较可信的。三个单克隆三个不同结果也可以理解，基因应该是单拷贝的，都连进去了，但连的是不同的基因，是前面实验的问题。三个里面如果有一个是你要的，就挑取那个单克 ...

现在的问题是这三个非常接近的说，而且我也确定不了哪个是我要的，非常纠结呢！
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5楼2011-07-06 17:52:54
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+3): 2011-07-06 18:50:19
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Originally posted by friya0910 at 2011-07-06 17:52:54:
现在的问题是这三个非常接近的说，而且我也确定不了哪个是我要的，非常纠结呢！

不知道你三个接近到什么程度？如果这基因是PCR来的，只是几个碱基不一样，换个高保真的聚合酶重新弄过；如果你的目的是要表达蛋白的话也无需纠结，三个一起做表达测定活性看看。
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6楼2011-07-06 18:48:13
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by lxj341401 at 2011-07-06 18:48:13:
不知道你三个接近到什么程度？如果这基因是PCR来的，只是几个碱基不一样，换个高保真的聚合酶重新弄过；如果你的目的是要表达蛋白的话也无需纠结，三个一起做表达测定活性看看。

其实我之前在ＤＮＡ上做PCR的时候就发现这个基因是多拷贝的，现在做表达呢，问题是我送出去测3个样就测出来三个序列，我怕还有更多的拷贝呢，我打算再送三个样测测看。其实互相之间碱基差得不到10个吧，翻译成蛋白也就差两三个氨基酸。
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7楼2011-07-06 20:29:14
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amilie030312

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dhd997(金币+2): good 2011-07-07 07:42:09
如果相差不大说明你做克隆时用的PCR酶不是高保真酶，估计你被商家忽悠了。如果差距不叫大可以重测一下，有重叠峰的话测序公司一般是会告诉你的，如果酶也换了高保真酶再测序还发现有不一样的，那就有可能是不同的剪切子了，恭喜你再做些东西整理一下可以发个要求不太高的文章了。
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8楼2011-07-06 23:30:51
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by amilie030312 at 2011-07-06 23:30:51:
如果相差不大说明你做克隆时用的PCR酶不是高保真酶，估计你被商家忽悠了。如果差距不叫大可以重测一下，有重叠峰的话测序公司一般是会告诉你的，如果酶也换了高保真酶再测序还发现有不一样的，那就有可能是不同的 ...

怎么说呢，我的目的片段是297bp，然后送三个样，测出来有三个位点是不一样的，有的是1、2一样，3不一样，有的是2、3一样，1不一样；翻译成蛋白，1和2完全一样，3号有一个位点和它们不一样；我刚咨询了一下公司，说他们的酶的保真性能达到95%以上，不应该是错配。测序的峰图也挺好的。选了两个样重测以后还是和以前一样，应该可以排除测序出现错误的问题。还有弱弱的问一下，什么叫剪切子不一样啊？
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9楼2011-07-07 15:34:15
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amilie030312

金虫 (正式写手)
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Originally posted by friya0910 at 2011-07-07 15:34:15:
怎么说呢，我的目的片段是297bp，然后送三个样，测出来有三个位点是不一样的，有的是1、2一样，3不一样，有的是2、3一样，1不一样；翻译成蛋白，1和2完全一样，3号有一个位点和它们不一样；我刚咨询了一下公司 ...

不用说了，你被忽悠了，换一家专业点的公司买酶吧。说吧，你用的啥牌子的酶啊？让大家共同来批判一下引以为戒。
不过也不一定，我觉得第一个和第二个没有引起编码改变的倒是可以接受的，是不是同源密码啊，但第三个不一样的我估计就是值得讨论一下了。
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10楼2011-07-07 23:42:22
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