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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序的问题
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by amilie030312 at 2011-07-07 23:42:22:
不用说了，你被忽悠了，换一家专业点的公司买酶吧。说吧，你用的啥牌子的酶啊？让大家共同来批判一下引以为戒。
不过也不一定，我觉得第一个和第二个没有引起编码改变的倒是可以接受的，是不是同源密码啊，但 ...

我用的是天根的一步法RT-PCR试剂盒，试剂盒里用的是热启酶，我咨询过他们公司，说是酶的保真性还是挺好的呀，而且他们的技术人员还跟我说290多的片段就出现三个位点的差异，应该不是错配的问题，错配的概率没有那么高，我都糊涂了。我之前在DNA上扩增的时候就发现这个基因是多拷贝的，内含子的差异非常大，但翻译成蛋白的差异就不是很大，您觉得会不会是基因本身的问题啊？
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11楼2011-07-08 09:27:10
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-07-07 23:42:22:
不用说了，你被忽悠了，换一家专业点的公司买酶吧。说吧，你用的啥牌子的酶啊？让大家共同来批判一下引以为戒。
不过也不一定，我觉得第一个和第二个没有引起编码改变的倒是可以接受的，是不是同源密码啊，但 ...

老师说可能是基因家族数量的问题，说如果深入研究说不定能发篇不错的文章，可是如果是基因家族的话，会差别这么小吗？我本来的实验方向是要做蛋白表达的，现在我都糊涂了，不知道下面该怎么去做了，望大侠指点一下啊！
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12楼2011-07-08 09:30:36
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
酶的问题吧！！
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jiayoubashaonian
13楼2011-07-08 09:56:51
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-07-10 21:35:54
先换个好点的酶扩扩看吧，先把酶的问题引起的错配避免掉再说下面的吧，我当年被Takara的酶忽悠的就差点误入歧途了，以为我发现了啥举世瞩目的神奇结果呢，最后证明只是酶保真性不行，出现错配了，浪费了我的大好青春啊
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14楼2011-07-10 19:20:57
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
多送几个克隆？
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15楼2011-07-10 19:34:27
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by xp198766 at 2011-07-10 19:34:27:
多送几个克隆？

挑了６个单克隆，送了三个，剩下的三个放４度保存了３天，然后加了含有抗生素的ＬＢ里摇，摇出来以后再送出去测序，可是结果很奇怪，三个里只有一个正常，一个出现了碱基缺失，另一个压根找不到下游引物，ＴＡ克隆位点里的片段大小也不对，可是之前菌落ＰＣＲ的片段大小是对的，这是不是跟重摇一次又关啊？困惑了！
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16楼2011-07-10 19:44:01
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
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Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:44:01:
挑了６个单克隆，送了三个，剩下的三个放４度保存了３天，然后加了含有抗生素的ＬＢ里摇，摇出来以后再送出去测序，可是结果很奇怪，三个里只有一个正常，一个出现了碱基缺失，另一个压根找不到下游引物，ＴＡ ...

平板不在了吗？再挑几个试试呢？或者重新做，我觉得如何是做表达的话，看看能不能联到表达载体上面再测试
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17楼2011-07-10 19:46:54
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by xp198766 at 2011-07-10 19:46:54:
平板不在了吗？再挑几个试试呢？或者重新做，我觉得如何是做表达的话，看看能不能联到表达载体上面再测试

平板还在呢！您的意思是随便取一个做表达吗？问题是有不一样的，我也不知道取哪条做表达比较好啊，还是都做呢？而且我送三个样三个都不一样，我怕还有更多的不同序列呢！
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18楼2011-07-10 19:59:58
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
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Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:59:58:
平板还在呢！您的意思是随便取一个做表达吗？问题是有不一样的，我也不知道取哪条做表达比较好啊，还是都做呢？而且我送三个样三个都不一样，我怕还有更多的不同序列呢！

我觉得是不是可以先酶切，多连接几个菌到表达载体上，先去测序，测序准确的再继续做表达。。
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19楼2011-07-10 20:08:03
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friya0910

新虫 (正式写手)
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Originally posted by xp198766 at 2011-07-10 20:08:03:
我觉得是不是可以先酶切，多连接几个菌到表达载体上，先去测序，测序准确的再继续做表达。。

现在问题是我也不知道准确的序列是什么，因为我做的是和别人文献不同的百合品种，所以有可能会出现差异的！而且这个基因应该是多拷贝的，都不知道别人是怎么做到单一序列的，老师说估计他们可能也是随便取了一条做表达的！
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20楼2011-07-10 20:16:21
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