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friya0910

新虫 (正式写手)

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Originally posted by amilie030312 at 2011-07-07 23:42:22:
不用说了,你被忽悠了,换一家专业点的公司买酶吧。说吧,你用的啥牌子的酶啊?让大家共同来批判一下引以为戒。
不过也不一定,我觉得第一个和第二个没有引起编码改变的倒是可以接受的,是不是同源密码啊,但 ...

我用的是天根的一步法RT-PCR试剂盒,试剂盒里用的是热启酶,我咨询过他们公司,说是酶的保真性还是挺好的呀,而且他们的技术人员还跟我说290多的片段就出现三个位点的差异,应该不是错配的问题,错配的概率没有那么高,我都糊涂了。我之前在DNA上扩增的时候就发现这个基因是多拷贝的,内含子的差异非常大,但翻译成蛋白的差异就不是很大,您觉得会不会是基因本身的问题啊?
11楼2011-07-08 09:27:10
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-07-07 23:42:22:
不用说了,你被忽悠了,换一家专业点的公司买酶吧。说吧,你用的啥牌子的酶啊?让大家共同来批判一下引以为戒。
不过也不一定,我觉得第一个和第二个没有引起编码改变的倒是可以接受的,是不是同源密码啊,但 ...

老师说可能是基因家族数量的问题,说如果深入研究说不定能发篇不错的文章,可是如果是基因家族的话,会差别这么小吗?我本来的实验方向是要做蛋白表达的,现在我都糊涂了,不知道下面该怎么去做了,望大侠指点一下啊!
12楼2011-07-08 09:30:36
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

酶的问题吧!!
jiayoubashaonian
13楼2011-07-08 09:56:51
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-07-10 21:35:54
先换个好点的酶扩扩看吧,先把酶的问题引起的错配避免掉再说下面的吧,我当年被Takara的酶忽悠的就差点误入歧途了,以为我发现了啥举世瞩目的神奇结果呢,最后证明只是酶保真性不行,出现错配了,浪费了我的大好青春啊
14楼2011-07-10 19:20:57
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~!

多送几个克隆?
15楼2011-07-10 19:34:27
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friya0910

新虫 (正式写手)

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Originally posted by xp198766 at 2011-07-10 19:34:27:
多送几个克隆?

挑了6个单克隆,送了三个,剩下的三个放4度保存了3天,然后加了含有抗生素的LB里摇,摇出来以后再送出去测序,可是结果很奇怪,三个里只有一个正常,一个出现了碱基缺失,另一个压根找不到下游引物,TA克隆位点里的片段大小也不对,可是之前菌落PCR的片段大小是对的,这是不是跟重摇一次又关啊?困惑了!
16楼2011-07-10 19:44:01
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~!


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Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:44:01:
挑了6个单克隆,送了三个,剩下的三个放4度保存了3天,然后加了含有抗生素的LB里摇,摇出来以后再送出去测序,可是结果很奇怪,三个里只有一个正常,一个出现了碱基缺失,另一个压根找不到下游引物,TA ...

平板不在了吗?再挑几个试试呢?或者重新做,我觉得如何是做表达的话,看看能不能联到表达载体上面再测试
17楼2011-07-10 19:46:54
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friya0910

新虫 (正式写手)

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Originally posted by xp198766 at 2011-07-10 19:46:54:
平板不在了吗?再挑几个试试呢?或者重新做,我觉得如何是做表达的话,看看能不能联到表达载体上面再测试

平板还在呢!您的意思是随便取一个做表达吗?问题是有不一样的,我也不知道取哪条做表达比较好啊,还是都做呢?而且我送三个样三个都不一样,我怕还有更多的不同序列呢!
18楼2011-07-10 19:59:58
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~!


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Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:59:58:
平板还在呢!您的意思是随便取一个做表达吗?问题是有不一样的,我也不知道取哪条做表达比较好啊,还是都做呢?而且我送三个样三个都不一样,我怕还有更多的不同序列呢!

我觉得是不是可以先酶切,多连接几个菌到表达载体上,先去测序,测序准确的再继续做表达。。
19楼2011-07-10 20:08:03
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friya0910

新虫 (正式写手)

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Originally posted by xp198766 at 2011-07-10 20:08:03:
我觉得是不是可以先酶切,多连接几个菌到表达载体上,先去测序,测序准确的再继续做表达。。

现在问题是我也不知道准确的序列是什么,因为我做的是和别人文献不同的百合品种,所以有可能会出现差异的!而且这个基因应该是多拷贝的,都不知道别人是怎么做到单一序列的,老师说估计他们可能也是随便取了一条做表达的!
20楼2011-07-10 20:16:21
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