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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr产物测序问题
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happywoheni

铁虫 (小有名气)

[求助] pcr产物测序问题

前两天把pcr产物送去测序了，只有上下游引物没有测出来，比目的基因少了几十bp,这样得到的序列有用吗？是不是要进行下一步连接转化后再测序更好？
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1楼2011-07-22 12:08:43
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
happywoheni(金币+1): 2011-07-22 12:35:53
西瓜(金币+2): good 2011-07-22 16:51:53
测PCR产物不是上下游引物没测出来而是测不出来，如果你对当前的测序原理懂的话就知道为什么测不出来了，如果想得到全序列的信息必须要连到载体上，让后从载体上找引物来测，所以连转这一步是绝对有必要的
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2楼2011-07-22 12:28:06
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-07-22 16:52:07
（1）请公司重测，无需缴费。
（2）请查看是否只是下游引物未测出来，上游有可能是非特异结合（即序列与你的引物序列仅有1个甚至几个碱基的差别）
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3楼2011-07-22 12:30:03
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你的引物设计在什么位置？
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4楼2011-07-22 12:32:04
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
差几十bp，算了下，差不多就是上下游引物的。那下一步做转化再测序吧！这样就可以测全吧
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5楼2011-07-22 12:38:48
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 高手有时间可以解释下测序原理嘛，嘿嘿 2011-07-22 16:52:47
引用回帖:
Originally posted by chenguestc at 2011-07-22 12:30:03:
（1）请公司重测，无需缴费。
（2）请查看是否只是下游引物未测出来，上游有可能是非特异结合（即序列与你的引物序列仅有1个甚至几个碱基的差别）

测序结果是从引物3‘最后一个碱基的下一个碱基开始的，先搞明白测序的原理再分析原因
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6楼2011-07-22 12:43:57
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healerly

禁虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): good 2011-07-22 16:52:53
本帖内容被屏蔽
7楼2011-07-22 15:50:26
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
双脱氧链终止法测序原理：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
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8楼2011-07-22 20:37:43
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12zhangwei

新虫 (小有名气)
要是做表达那一定要知道全长喽，一般引物后30-50bp测的不准确所以连接载体用载体引物测序
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9楼2011-07-22 20:41:28
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
如果只做克隆，难道这样的少了上下游引物的序列也可以？不行吧，还不是一样得知道全长。
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10楼2011-07-22 20:43:34
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