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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆测序问题
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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】克隆测序问题 已有1人参与

最近做基因表达，挑克隆测序在引物的位置（酶切位点附近）总是少一个核苷酸。实验重复了好几遍，自己怀疑是引物不纯，换了家公司合成引物还是出现同样的问题。引物采用的是page纯化，难道纯度不够吗？或者是载体有问题，还是感受态菌复制系统出了问题，想不明白？望达人不吝赐教。实验重复了五六遍了。。。。诶
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1楼 2010-10-12 12:36:54
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jasco

木虫 (正式写手)
brightjoe(金币+1):谢谢回复 2010-10-12 15:08:01
测序峰图看了么？使用pcr引物测的还是通用引物测的？
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2楼2010-10-12 12:41:08
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2):非常活跃，不错！ 2010-10-12 19:37:50
出问题的位置和测序引物之间距离多远？是否双向测通确认的确有一个碱基缺失，而不是因为测序开始的几十bp测不准引起的？看看测序峰形

换公司合成引物，在同样的位置出现缺失的概率太低了吧。
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3楼2010-10-12 12:45:24
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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-12 12:45:24:
出问题的位置和测序引物之间距离多远？是否双向测通确认的确有一个碱基缺失，而不是因为测序开始的几十bp测不准引起的？看看测序峰形

换公司合成引物，在同样的位置出现缺失的概率太低了吧。

是通用引物测得，峰图可以的，我挑的克隆测序确实的碱基也不是都在同一位置，有没有可能是载体的原因呢？
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4楼2010-10-12 12:58:46
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ben1147

木虫 (正式写手)
brightjoe(金币+10):谢谢赐教，谢谢赐教！确实是缺失不同的碱基，不过同一个样品还没有测过两次，那测序图谱是好的能说明测序结果没问题吗？ 2010-10-12 15:07:10
引用回帖:
Originally posted by brightjoe at 2010-10-12 12:58:46:


是通用引物测得，峰图可以的，我挑的克隆测序确实的碱基也不是都在同一位置，有没有可能是载体的原因呢？

你说的“缺失在引物上”是在插入片段的引物上么？
如果是的话，和载体没什么关系吧

用同一个克隆测多个反应，结果里面缺失的位置相同么？如果相同，说明确实存在这样一个缺失，可能确实是引物的问题；如果不同，则可能是测序的问题，比如这里的序列比较特殊，或者连接位点附近，载体序列和片段序列恰好形成某种结构，导致测序酶在这里发生slip，或者测序信号在这里发生压缩错位，这都有可能的，尤其是在每次缺失的位置都不一样，无法得到一个稳定结果的情况下。
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5楼2010-10-12 13:55:54
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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-12 13:55:54:

你说的“缺失在引物上”是在插入片段的引物上么？
如果是的话，和载体没什么关系吧

用同一个克隆测多个反应，结果里面缺失的位置相同么？如果相同，说明确实存在这样一个缺失，可能确实是引物的问题；如果不 ...

谢谢赐教！确实是缺失不同的碱基，不过同一个样品还没有测过两次，那测序图谱是好的能说明测序结果没问题吗？
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6楼2010-10-12 15:06:53
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
酶切位点的保护碱基要加好，不同的酶加的保护碱基个数是不一样的啊，要不然会造成酶切不充分或不准确。
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7楼2010-10-12 15:45:02
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