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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

[求助] DGGE胶回收问题

DGGE胶怎样回收?跑一次DGGE,回收胶PCR后可以测序吗?一般用常规测序还是克隆测序?还有我用的是巢式PCR,测序时的引物该用目的片段的引物吗?还是两对引物都要?
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-12 21:00:23
piaoyuaaa(金币+2): 2011-07-13 15:09:29
回收后需要采用没有GC夹子的引物进行PCR扩增,产物克隆后测序。
克隆后采用载体引物测序就可以了
2楼2011-07-12 13:38:32
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-12 13:38:32:
回收后需要采用没有GC夹子的引物进行PCR扩增,产物克隆后测序。
克隆后采用载体引物测序就可以了

我回收了一次DGGE胶,然后用没有带夹子的引物做PCR,扩出来的目的条带很亮,但紧挨着目的条带上方有不很亮的条带,若不仔细看就是和目的片段连到一起了,不知道什么原因
http://good.gd/1394954.htm
3楼2011-07-13 15:09:03
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

你的是什么样本啊?不会是植物的吧?
不用管上面这个带,直接克隆后去阳性克隆就可以了。两个片段离得很远,筛选阳性克隆时能够区分开。
4楼2011-07-14 08:38:08
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-14 08:38:08:
你的是什么样本啊?不会是植物的吧?
不用管上面这个带,直接克隆后去阳性克隆就可以了。两个片段离得很远,筛选阳性克隆时能够区分开。

你们都是自己做的克隆吗?没做过克隆,感觉挺难的,实验室条件也不成熟,要是让公司去克隆测序,一个反应两百多,好贵
5楼2011-07-15 09:07:52
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

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Originally posted by piaoyuaaa at 2011-07-15 09:07:52:
你们都是自己做的克隆吗?没做过克隆,感觉挺难的,实验室条件也不成熟,要是让公司去克隆测序,一个反应两百多,好贵

是啊。自己做克隆麻烦,省钱。公司给做肯定得200多啊,人力成本高啊。
6楼2011-07-15 09:56:59
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-15 09:56:59:
是啊。自己做克隆麻烦,省钱。公司给做肯定得200多啊,人力成本高啊。

哎,关键是没有做过克隆,条件肯定不具备,技术也不行,咋办才好,要是能直接测序就好了,我的PCR产物不纯,要是把目的带切下来回收再用试剂盒纯化,直接测序也不知道行不行
7楼2011-07-15 10:36:22
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by piaoyuaaa at 2011-07-15 10:36:22:
哎,关键是没有做过克隆,条件肯定不具备,技术也不行,咋办才好,要是能直接测序就好了,我的PCR产物不纯,要是把目的带切下来回收再用试剂盒纯化,直接测序也不知道行不行

不行。
DGGE的条带是一定要克隆测序的。不然测序90%都得失败。
8楼2011-07-15 10:37:58
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-15 10:37:58:
不行。
DGGE的条带是一定要克隆测序的。不然测序90%都得失败。

克隆测序的话,我就跑了一次DGGE,而且我的PCR产物不纯,就是在紧挨着目的条带上方有个杂带,克隆测序行吗?还是需要跑两次DGGE,把PCR产物纯化好才能克隆测序?谢谢
9楼2011-07-15 10:56:59
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

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Originally posted by piaoyuaaa at 2011-07-15 10:56:59:
克隆测序的话,我就跑了一次DGGE,而且我的PCR产物不纯,就是在紧挨着目的条带上方有个杂带,克隆测序行吗?还是需要跑两次DGGE,把PCR产物纯化好才能克隆测序?谢谢

dgge凝胶切胶回收后pcr,pcr产物克隆测序。
10楼2011-07-15 14:42:53
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