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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DGGE胶回收问题
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

[求助] DGGE胶回收问题

DGGE胶怎样回收？跑一次DGGE，回收胶PCR后可以测序吗？一般用常规测序还是克隆测序？还有我用的是巢式PCR，测序时的引物该用目的片段的引物吗？还是两对引物都要？
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1楼 2011-07-12 12:47:38
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-12 21:00:23
piaoyuaaa(金币+2): 2011-07-13 15:09:29
回收后需要采用没有GC夹子的引物进行PCR扩增，产物克隆后测序。
克隆后采用载体引物测序就可以了
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2楼2011-07-12 13:38:32
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-12 13:38:32:
回收后需要采用没有GC夹子的引物进行PCR扩增，产物克隆后测序。
克隆后采用载体引物测序就可以了

我回收了一次DGGE胶，然后用没有带夹子的引物做PCR,扩出来的目的条带很亮，但紧挨着目的条带上方有不很亮的条带，若不仔细看就是和目的片段连到一起了，不知道什么原因
http://good.gd/1394954.htm
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3楼2011-07-13 15:09:03
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
你的是什么样本啊？不会是植物的吧？
不用管上面这个带，直接克隆后去阳性克隆就可以了。两个片段离得很远，筛选阳性克隆时能够区分开。
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4楼2011-07-14 08:38:08
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-14 08:38:08:
你的是什么样本啊？不会是植物的吧？
不用管上面这个带，直接克隆后去阳性克隆就可以了。两个片段离得很远，筛选阳性克隆时能够区分开。

你们都是自己做的克隆吗？没做过克隆，感觉挺难的，实验室条件也不成熟，要是让公司去克隆测序，一个反应两百多，好贵
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5楼2011-07-15 09:07:52
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
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Originally posted by piaoyuaaa at 2011-07-15 09:07:52:
你们都是自己做的克隆吗？没做过克隆，感觉挺难的，实验室条件也不成熟，要是让公司去克隆测序，一个反应两百多，好贵

是啊。自己做克隆麻烦，省钱。公司给做肯定得200多啊，人力成本高啊。
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6楼2011-07-15 09:56:59
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)
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Originally posted by xiadongliang at 2011-07-15 09:56:59:
是啊。自己做克隆麻烦，省钱。公司给做肯定得200多啊，人力成本高啊。

哎，关键是没有做过克隆，条件肯定不具备，技术也不行，咋办才好，要是能直接测序就好了，我的PCR产物不纯，要是把目的带切下来回收再用试剂盒纯化，直接测序也不知道行不行
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7楼2011-07-15 10:36:22
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by piaoyuaaa at 2011-07-15 10:36:22:
哎，关键是没有做过克隆，条件肯定不具备，技术也不行，咋办才好，要是能直接测序就好了，我的PCR产物不纯，要是把目的带切下来回收再用试剂盒纯化，直接测序也不知道行不行

不行。
DGGE的条带是一定要克隆测序的。不然测序90%都得失败。
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8楼2011-07-15 10:37:58
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-07-15 10:37:58:
不行。
DGGE的条带是一定要克隆测序的。不然测序90%都得失败。

克隆测序的话，我就跑了一次DGGE,而且我的PCR产物不纯，就是在紧挨着目的条带上方有个杂带，克隆测序行吗？还是需要跑两次DGGE,把PCR产物纯化好才能克隆测序？谢谢
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9楼2011-07-15 10:56:59
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xiadongliang

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by piaoyuaaa at 2011-07-15 10:56:59:
克隆测序的话，我就跑了一次DGGE,而且我的PCR产物不纯，就是在紧挨着目的条带上方有个杂带，克隆测序行吗？还是需要跑两次DGGE,把PCR产物纯化好才能克隆测序？谢谢

dgge凝胶切胶回收后pcr,pcr产物克隆测序。
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10楼2011-07-15 14:42:53
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