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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)

[交流] 【求助/交流】克隆测序问题已有1人参与

最近做基因表达,挑克隆测序在引物的位置(酶切位点附近)总是少一个核苷酸。实验重复了好几遍,自己怀疑是引物不纯,换了家公司合成引物还是出现同样的问题。引物采用的是page纯化,难道纯度不够吗?或者是载体有问题,还是感受态菌复制系统出了问题,想不明白?望达人不吝赐教。实验重复了五六遍了。。。。诶
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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-12 13:55:54:

你说的“缺失在引物上”是在插入片段的引物上么?
如果是的话,和载体没什么关系吧

用同一个克隆测多个反应,结果里面缺失的位置相同么?如果相同,说明确实存在这样一个缺失,可能确实是引物的问题;如果不 ...

谢谢赐教!确实是缺失不同的碱基,不过同一个样品还没有测过两次,那测序图谱是好的能说明测序结果没问题吗?
6楼2010-10-12 15:06:53
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jasco

木虫 (正式写手)

brightjoe(金币+1):谢谢回复 2010-10-12 15:08:01
测序峰图看了么?使用pcr引物测的还是通用引物测的?
2楼2010-10-12 12:41:08
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★
amisking(金币+2):非常活跃,不错! 2010-10-12 19:37:50
出问题的位置和测序引物之间距离多远?是否双向测通确认的确有一个碱基缺失,而不是因为测序开始的几十bp测不准引起的?看看测序峰形

换公司合成引物,在同样的位置出现缺失的概率太低了吧。
3楼2010-10-12 12:45:24
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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-10-12 12:45:24:
出问题的位置和测序引物之间距离多远?是否双向测通确认的确有一个碱基缺失,而不是因为测序开始的几十bp测不准引起的?看看测序峰形

换公司合成引物,在同样的位置出现缺失的概率太低了吧。

是通用引物测得,峰图可以的,我挑的克隆测序确实的碱基也不是都在同一位置,有没有可能是载体的原因呢?
4楼2010-10-12 12:58:46
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