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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关克隆方面的问题
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】有关克隆方面的问题 已有4人参与

本人在做两个基因的克隆，使用Takara的EXtaq扩增出了DNA全长，分别为1800bp和3000bp左右，使用pMD18-T载体做T-A克隆。   
   1800bp左右的菌液PCR得到了和我目的条带一致的条带，送样测序结果找不到引物，经过BLAST比对后发现根本不是我要的目的条带，很困惑，为什么测序的结果找不到引物呢，是不是因为没连接上。或者是我根本就没扩出目的条带？可是测序结果总要找到引物啊。我的连接体系是1μl载体，4μlDNA, 5μl SoulutionⅠ，16℃连接了1天，按道理来说1800bp左右的片段连接过夜就可以了，为什么1天了也连接不上啊。
   另外想问一下3000bp的片段takara的载体不是很好连啊，我都做了2次了，都是没有结果，郁闷死了，哪位高手能提供点意见啊。
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1楼 2010-11-03 16:24:05
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yanliruqun

新虫 (初入文坛)
★ ★
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scelab(金币+1):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-03 23:34:26
Takara 的pMD18-T
适合于连1000以下的片段，2000以上的很难连，建议用KS2载体
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2楼2010-11-03 23:27:13
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
★
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我有个疑问，如果没有扩出目的条带为什么会P出和你目的条带一致的条带？
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3楼2010-11-04 14:52:24
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playboy723

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3):good 2010-11-04 18:30:35
发表下看法：
1、不建议用EXtaq，这个酶扩短点儿的片段还行，1000bp以上就会出现很多错配了，即使连上了也没法用，找个pfu系列的高保真酶扩吧，我用takara公司的primerstar酶扩3000bp没有错配或缺失，建议你用这个
2、1800bp连T载体效率已经很低了，3000bp连的话基本靠运气，成功率极低，不过你可以不断的试，直到连上为止。建议你分成2段来扩，分别连到T载体上，测序成功后再连到一起，这样把握大些。
3、PCR时退火温度高些较好，没有非特异的杂带，另外操作时尽量要严谨，避免出现不明的现象。
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4楼2010-11-04 15:44:21
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friend.11

金虫 (正式写手)
★
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我也曾经出现过跟你一样的情况，我也不知道是为什么。我当时刚刚换了测序公司（原来是Invitrogen，后来换到华大），我以为是测序公司的问题，因为不可能连载体上的引物都找不到啊！不过我还是重做一次。
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5楼2010-11-04 19:33:09
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