| 查看: 902 | 回复: 4 | ||
[求助]
载体构建 求助
|
||
| 我现在做的是将1400bp的目的片段连接到1301载体上，具体方法是，先将添加了Xbal和BamH1酶切位点的pcr产物与pmd18-T连接后转化到感受态细胞中，提取质粒。用Xbal和BamH1分别双酶切含有目的片段的质粒和1301质粒。酶切产物胶回收后用solution1 4度连接过夜，之后将连接产物转化到感受态上，可是每次培养基上都不长菌，不知道是不是连接体系有问题，（1：1,1:2，1：1：3,1:4，1:5的体系我都试过，就是不长菌），这个实验我做了好长时间了，就是不成功，还望哪位仁兄给指点一下。不胜感激！ |
回复此楼» 猜你喜欢
焦虑
已经有10人回复
-
298-一志愿中国农业大学-求调剂
已经有3人回复
-
265求调剂
已经有3人回复
-
297求调剂
已经有3人回复
-
302求调剂
已经有8人回复
-
环境工程调剂
已经有7人回复
-
268求调剂
已经有6人回复
-
311求调剂
已经有11人回复
-
工科材料085601 279求调剂
已经有4人回复
-
301求调剂
已经有9人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 【求助/交流】表达载体pCAMBIA1304表达顺序看不懂
已经有12人回复
- 表达载体的构建
已经有17人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 【求助/交流】表达载体转化后,提取的质粒和原来不一样了啊
已经有5人回复
- 【求助/交流】pYES2 载体构建表达方向的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】求构载体高手 赐教构建亚细胞定位载体pCAMBIA1302
已经有4人回复
- 【求助/交流】启动子缺失载体的构建
已经有6人回复
- 【求助/交流】同尾酶构建载体问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】可不可以不构建载体
已经有9人回复
- 【求助/交流】载体构建，急需，在线等
已经有5人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】载体构建方面的问题
已经有7人回复
- 【求助/交流】在构建基因表达载体的时候什么时候需要人为地在上面加上启动子？
已经有6人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
dshlove
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 9
- 应助: 237 (大学生)
- 金币: 4764.7
- 散金: 20
- 红花: 10
- 帖子: 852
- 在线: 419.2小时
- 虫号: 1609389
- 注册: 2012-02-10
- 性别: GG
- 专业: 污染控制化学
3楼2012-09-19 17:06:14
gaorongbest
新虫 (小有名气)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 147.7
- 红花: 1
- 帖子: 103
- 在线: 18.3小时
- 虫号: 1726688
- 注册: 2012-03-30
- 性别: MM
- 专业: 细胞生物学研究中的新方法
2楼2012-09-19 15:34:51
joan198108
铁杆木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 107 (高中生)
- 金币: 6525.2
- 散金: 12
- 红花: 3
- 帖子: 842
- 在线: 413.5小时
- 虫号: 859607
- 注册: 2009-09-29
- 性别: GG
- 专业: 生物技术药物
4楼2012-09-20 10:52:39
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+5, 鼓励交流和分享 2012-09-20 13:41:47
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+5, 鼓励交流和分享 2012-09-20 13:41:47
|
不长菌，首先要考虑的是抗性有没有用错，或者1301质粒有没有问题。所以正如第一楼所说的一样，做一个1301质粒的直接转化做对照就可以排除这个问题。 然后。如果对照组长得好的话，说明就是连接的问题了。如果对照组长得少的话，就是感受态的效率低。如果感受态效率低的话，也会导致连接产物转化长的菌少甚至不长。 如果上面都没问题，只是连接产物转化没长的话，就好好优化下连接体系。按照各种说明书来。不过我一般都很随便的。做双切连接都很好挑阳性克隆，基本上全是阳性克隆，而且板子长得都还行。连接体系根本不CARE，尽量多加片段就可以了。 |
5楼2012-09-20 13:04:12
