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载体构建 求助
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| 我现在做的是将1400bp的目的片段连接到1301载体上，具体方法是，先将添加了Xbal和BamH1酶切位点的pcr产物与pmd18-T连接后转化到感受态细胞中，提取质粒。用Xbal和BamH1分别双酶切含有目的片段的质粒和1301质粒。酶切产物胶回收后用solution1 4度连接过夜，之后将连接产物转化到感受态上，可是每次培养基上都不长菌，不知道是不是连接体系有问题，（1：1,1:2，1：1：3,1:4，1:5的体系我都试过，就是不长菌），这个实验我做了好长时间了，就是不成功，还望哪位仁兄给指点一下。不胜感激！ |
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【答案】应助回帖
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不长菌，首先要考虑的是抗性有没有用错，或者1301质粒有没有问题。所以正如第一楼所说的一样，做一个1301质粒的直接转化做对照就可以排除这个问题。 然后。如果对照组长得好的话，说明就是连接的问题了。如果对照组长得少的话，就是感受态的效率低。如果感受态效率低的话，也会导致连接产物转化长的菌少甚至不长。 如果上面都没问题，只是连接产物转化没长的话，就好好优化下连接体系。按照各种说明书来。不过我一般都很随便的。做双切连接都很好挑阳性克隆，基本上全是阳性克隆，而且板子长得都还行。连接体系根本不CARE，尽量多加片段就可以了。 |
5楼2012-09-20 13:04:12