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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】可不可以不构建载体
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痴书小孩

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】可不可以不构建载体 已有9人参与

请问大家，为什么要构建载体啊，我可不可以跑完PCR，电泳后回收直接拿去测序，为什么连到质粒上还要转到大肠杆菌里面去？
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1楼 2010-08-26 08:58:20
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周_yan

木虫 (小有名气)
★ ★
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lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-08-26 09:24:01
我认为电泳回收后可以直接测序，而连入T载体再去测序一是为了测序更容易；二是方便后面构建表达载体。
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2楼2010-08-26 09:12:47
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cheo163

金虫 (小有名气)
★ ★
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看天(金币+1):鼓励回答 2010-08-26 09:27:26
把你回收的产物和你pcr的引物一起送去测，我觉得是可以的~~
只是这样回收产物不是很好保存吧~~
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3楼2010-08-26 09:23:11
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jukongka

铁杆木虫 (著名写手)

年度最忠心木虫
★
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二楼说的很对，如果后续要做表达研究的话，是克隆载体测序较好；
如果是仅仅是为了获得部分序列信息的话，不需要克隆，PCR产物直接测序即可
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4楼2010-08-26 11:05:29
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xppcomeon
★
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支持2楼
5楼2010-08-26 11:06:50
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banhf

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2):学问好啊 2010-08-26 15:06:47
PCR产物可以用来测序，但必须经过纯化。
将PCR产物连接至载体测序有两个目的：1 用载体上的通用引物测序可以保证测序质量；2 可以将PCR产物的整个序列全部测出。直接用PCR产物来测序可能会由于PCR引物不适合测序，与模板结合不好等原因而导致测序失败，而且即使测序成功了那PCR产物两端至少各50bp的序列是测不到的。
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6楼2010-08-26 13:12:38
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silicare

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★ ★ ★
1949stone(金币+3):好细致 2010-08-26 15:06:58
纠正一下：

PCR产物直接测序才能反应原始模板的序列情况

克隆到载体里边是为了要这段序列得以保存，并能够大量的保真性复制，以便于后期的基因组和蛋白质组学的研究

也就是说，如果克隆到载体，一定要首先知道这段序列的确切的碱基组成，把一个未知基因未经PCR产物测序就拿去克隆是不科学不可信的

因为PCR产物是一个含有少量突变的综合体，不管是用什么酶

而测序正好反应的就是全部的碱基信号，少量突变不会影响

这些突变一旦克隆到载体再测序就改变了对原始模板的认识

这就是为什么一般挑克隆去测序都要多挑几个，就是为了防止突变
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7楼2010-08-26 13:39:32
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痴书小孩

铁杆木虫 (小有名气)
I see,只不过我是要做植物病毒检测的，就是设计引物跑PCR然后测序啦，又不搞转基因，怎么看到的文献全部都构建载体的，没有直接测序的，真奇怪...
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8楼2010-08-27 08:19:27
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diana0423

金虫 (小有名气)
★ ★
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silicare(金币+1):谢谢参与 2010-08-27 20:37:58
直接测序的话两端会有一些碱基序列是测不准的
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9楼2010-08-27 20:09:59
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tiani_tan

金虫 (小有名气)
★
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用载体测序的话，一般就是简单的TA克隆，也不是很麻烦，而直接用PCR产物的话需要纯化，还有降解的可能
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10楼2010-08-27 21:37:17
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