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一笑35

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】连接转化,帮帮忙已有6人参与

最近几天一直在做真菌的连接转化,大约500bp左右的目的片段,可是转化后涂到板上的菌长的都特别小(包括阳性对照),看着很不正常,而且摇菌液测序结果也是信号弱,
   感受态用的是买DH5a,10微升的体系加入5微升目的片段
   

   不知道是什么原因,请大家帮着分析一下,谢谢啦!
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yuyan225

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我做转化也遇到过这种问题,感受态和DNA的量减少一点,在重新连试试
2楼2010-09-03 11:53:23
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怎么都行

银虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+3):鼓励交流! 2010-09-03 21:55:10
楼主做真菌的转化为什么用DH5a这种大肠杆菌感受态细胞呢?

菌落长的小说明它生长力弱了,一般DH5a生长16h以内就可以摇菌做菌落PCR鉴定了,如果16h还没长好80%的可能是感受态细胞过期了或保存条件不好。
3楼2010-09-03 12:07:00
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cheo163

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
感觉相比较目的片段的量,你的DH5少了,把量加大一点~~
4楼2010-09-03 12:57:49
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一笑35

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by 怎么都行 at 2010-09-03 12:07:00:
楼主做真菌的转化为什么用DH5a这种大肠杆菌感受态细胞呢?

菌落长的小说明它生长力弱了,一般DH5a生长16h以内就可以摇菌做菌落PCR鉴定了,如果16h还没长好80%的可能是感受态细胞过期了或保存条件不好。

那连接真菌应该用什么样的感受态呢?我以为跟细菌一样都可以用DH5a呢。
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5楼2010-09-03 14:26:47
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magician13

铁虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
什么叫连接真菌呢...是在大肠杆菌中构建适用于真菌的穿梭载体,还是要把现有的载体转到真菌中?
6楼2010-09-03 15:20:49
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一笑35

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by magician13 at 2010-09-03 15:20:49:
什么叫连接真菌呢...是在大肠杆菌中构建适用于真菌的穿梭载体,还是要把现有的载体转到真菌中?

我是说要连接到载体上的目的片段是真菌DNA,可不可以用DH5a感受态细胞
努力学习,充实自己!
7楼2010-09-03 16:02:52
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怎么都行

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我是说要连接到载体上的目的片段是真菌DNA,可不可以用DH5a感受态细胞 [/quote]
原来是这个意思,当然可以
8楼2010-09-03 20:39:05
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
菌落长的怎么样先别管,提质粒酶切试试嘛
一直向前!
9楼2010-09-04 15:39:02
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一笑35

铁虫 (初入文坛)

O了,我重新再试试,感谢各位回帖。。。
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10楼2010-09-05 09:11:07
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