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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化，帮帮忙
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一笑35

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】连接转化，帮帮忙 已有6人参与

最近几天一直在做真菌的连接转化，大约500bp左右的目的片段，可是转化后涂到板上的菌长的都特别小（包括阳性对照），看着很不正常，而且摇菌液测序结果也是信号弱，
   感受态用的是买DH5a，10微升的体系加入5微升目的片段
   

   不知道是什么原因，请大家帮着分析一下，谢谢啦！
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1楼 2010-09-03 11:01:53
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yuyan225

金虫 (小有名气)
★
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我做转化也遇到过这种问题，感受态和DNA的量减少一点，在重新连试试
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2楼2010-09-03 11:53:23
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怎么都行

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3):鼓励交流！ 2010-09-03 21:55:10
楼主做真菌的转化为什么用DH5a这种大肠杆菌感受态细胞呢？

菌落长的小说明它生长力弱了，一般DH5a生长16h以内就可以摇菌做菌落PCR鉴定了，如果16h还没长好80%的可能是感受态细胞过期了或保存条件不好。
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3楼2010-09-03 12:07:00
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cheo163

金虫 (小有名气)
★
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感觉相比较目的片段的量，你的DH5少了，把量加大一点~~
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4楼2010-09-03 12:57:49
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一笑35

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 怎么都行 at 2010-09-03 12:07:00:
楼主做真菌的转化为什么用DH5a这种大肠杆菌感受态细胞呢？

菌落长的小说明它生长力弱了，一般DH5a生长16h以内就可以摇菌做菌落PCR鉴定了，如果16h还没长好80%的可能是感受态细胞过期了或保存条件不好。

那连接真菌应该用什么样的感受态呢？我以为跟细菌一样都可以用DH5a呢。
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5楼2010-09-03 14:26:47
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magician13

铁虫 (初入文坛)
★
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什么叫连接真菌呢...是在大肠杆菌中构建适用于真菌的穿梭载体,还是要把现有的载体转到真菌中?
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6楼2010-09-03 15:20:49
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一笑35

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by magician13 at 2010-09-03 15:20:49:
什么叫连接真菌呢...是在大肠杆菌中构建适用于真菌的穿梭载体,还是要把现有的载体转到真菌中?

我是说要连接到载体上的目的片段是真菌DNA，可不可以用DH5a感受态细胞
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7楼2010-09-03 16:02:52
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怎么都行

银虫 (小有名气)
★
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我是说要连接到载体上的目的片段是真菌DNA，可不可以用DH5a感受态细胞 [/quote]
原来是这个意思，当然可以
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8楼2010-09-03 20:39:05
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★
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菌落长的怎么样先别管，提质粒酶切试试嘛
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一直向前！
9楼2010-09-04 15:39:02
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一笑35

铁虫 (初入文坛)
O了，我重新再试试，感谢各位回帖。。。
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10楼2010-09-05 09:11:07
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