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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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chs4502

金虫 (小有名气)

[求助] 求助带酶切位点的引物设计

我想将我的目的片段连接到PYeS 2载体中,但是我的我的目的片段的GC含量很高,超过了60%。以cDNA为模版的PCR一直跑不出来。希望虫友们帮我设计一对带酶切位点的引物。MCS参照PYeS 2载体。
5端:ATGTGCCAGGGACAGGCAGTCCAGGGTCTGAGGCGCCGGAGTTCATTCTTGAAGCTC…………TGGCTACTGGCACCTATCGTGTGCTGCAGCGCCTGGCAGACGTGGCAGCTGAGGCCTAG3端。
PS:最后不要加保护碱基了,否则引物的Tm就要超标了。
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review

银虫 (著名写手)

以其他的DNA为模板可以吗
交流
2楼2012-09-27 12:46:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

我也有相同的疑问。cDNA不行,什么模板可以做出PCR来?
3楼2012-09-27 13:12:37
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-27 14:04:29
引物设计没有教科书上说的那么严格,这个完全可以自己设计,保护碱基一定要加的,否则是不能识别两端的酶切位点的,这个一定要记住。而且GC含量高也不要紧的,退火温度可以到60,如果P不出来的话还可以用高GC的PCR啊,有专门的高GC buffer,这个你可以自己查查。TM超标什么的都是浮云,做多了你就知道了,我还用过50多bp的primer做PCR呢,绝对可以的。
哈哈
4楼2012-09-27 13:47:01
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houchm0927

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-28 14:42:04
具体理论不多说,说点自己做过的,仅供参考。设计引物时GC含量57-60%经常有,Tm60也做过,可以用。保护碱基曾有过没加的经历,没问题,有时加保护碱基也不是按理论上的碱基(当然别形成新的酶切位点),也没问题。总之,我跟人认为一般PCR引物设计没有那么严格。另外声明,我的模板都是质粒,不知道以cDNA为模板会如何。
5楼2012-09-27 20:42:42
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

确定你的cdna有没有问题
在这个纷绕的世俗世界里,能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切,也是一种境界。
6楼2012-09-28 10:04:43
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