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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助带酶切位点的引物设计
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chs4502

金虫 (小有名气)

[求助] 求助带酶切位点的引物设计

我想将我的目的片段连接到PYeS 2载体中，但是我的我的目的片段的GC含量很高，超过了60%。以cDNA为模版的PCR一直跑不出来。希望虫友们帮我设计一对带酶切位点的引物。MCS参照PYeS 2载体。
5端：ATGTGCCAGGGACAGGCAGTCCAGGGTCTGAGGCGCCGGAGTTCATTCTTGAAGCTC…………TGGCTACTGGCACCTATCGTGTGCTGCAGCGCCTGGCAGACGTGGCAGCTGAGGCCTAG3端。
PS：最后不要加保护碱基了，否则引物的Tm就要超标了。
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1楼 2012-09-03 08:12:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

我也有相同的疑问。cDNA不行，什么模板可以做出PCR来？
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3楼2012-09-27 13:12:37
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review

银虫 (著名写手)
以其他的DNA为模板可以吗
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交流
2楼2012-09-27 12:46:01
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-27 14:04:29
引物设计没有教科书上说的那么严格，这个完全可以自己设计，保护碱基一定要加的，否则是不能识别两端的酶切位点的，这个一定要记住。而且GC含量高也不要紧的，退火温度可以到60，如果P不出来的话还可以用高GC的PCR啊，有专门的高GC buffer，这个你可以自己查查。TM超标什么的都是浮云，做多了你就知道了，我还用过50多bp的primer做PCR呢，绝对可以的。
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哈哈
4楼2012-09-27 13:47:01
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houchm0927

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-09-28 14:42:04
具体理论不多说，说点自己做过的，仅供参考。设计引物时GC含量57-60%经常有，Tm60也做过，可以用。保护碱基曾有过没加的经历，没问题，有时加保护碱基也不是按理论上的碱基（当然别形成新的酶切位点），也没问题。总之，我跟人认为一般PCR引物设计没有那么严格。另外声明，我的模板都是质粒，不知道以cDNA为模板会如何。
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5楼2012-09-27 20:42:42
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