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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】pYES2 载体构建表达方向的问题

最近在做将质粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后将G418 基因扩增后连接进行质粒改造, 问题是在设计引物时扩增G418基因上游引物带有NdeI酶切位点,下游带有NheI 酶切位点,如图所示以GAL1启动子为1, 酶切位点NdeI(3700,如图在NheI的右侧),NheI (3840),请问各位虫友这样连接的话是不是外源的G418基因连接方向是反向的,我是否需要重新合成引物调换酶切位点? 谢谢帮忙!


[ Last edited by xtcao668 on 2011-4-13 at 09:02 ]
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haiyanli111

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by susizheng at 2011-04-13 09:35:55
你扩增G418基因的时候,是应该连带G418基因前面的启动子一起扩增的,是整个表达元件的扩增(仅扩增基因没办法表达哦),竟然是整个表达元件插入到载体,作为一个整体的表达单元在载体上正插入和反插入都能表达的 ...

你好!我也遇到了前面那位的问题,你说的表达元件是什么意思,我构建的时候直接在起始密码子和终止密码子前后加的酶切位点,这样是一个基因吧!谢谢指教!
5楼2013-06-17 09:30:00
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xtcao668(金币+1): 谢谢交流 2011-04-26 15:21:45
引用回帖:
Originally posted by xtcao668 at 2011-04-12 23:44:19:
最近在做将质粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后将G418 基因扩增后连接进行质粒改造, 问题是在设计引物时扩增G418基因上游引物带有NdeI酶切位点,下游带有NheI 酶切位点,如图所示以GAL1启动子为1, 酶切位 ...

NdeI(3700)在图上没看到呢 还是我眼浊了?
2楼2011-04-13 00:08:11
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)


在NheI的右侧,谢谢!图上忘了标注!
3楼2011-04-13 09:03:52
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★ ★ ★
xtcao668(金币+2): 谢谢帮忙! 2011-04-13 09:45:45
西瓜(金币+3): good 2011-04-13 10:33:35
xtcao668(金币+1): 谢谢! 2011-04-26 15:22:13
引用回帖:
Originally posted by xtcao668 at 2011-04-13 09:03:52:
在NheI的右侧,谢谢!图上忘了标注!

你扩增G418基因的时候,是应该连带G418基因前面的启动子一起扩增的,是整个表达元件的扩增(仅扩增基因没办法表达哦),竟然是整个表达元件插入到载体,作为一个整体的表达单元在载体上正插入和反插入都能表达的。
PS:你也看到了,质粒图谱箭头都有逆时针方向和顺时针方向同时存在的。
4楼2011-04-13 09:35:55
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