应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接连不上，要死了
241/3返回列表123下一页
查看: 3343  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接连不上，要死了 已有10人参与

如题，最近构建质粒，载体是pIMP，使用的是单酶切位点Nde1.然后用一步克隆的方法做连接转化，感受态是DH5&，做了四五次都是连不上，长出来的单菌落做PCR结果目的条带都P不出来，不知道是什么原因。换了新的一步克隆试剂盒做对比依然还是连不上，求大神分析分析啊。。。。。。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-08 15:37:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-08 18:14:47
具体步骤怎样啊？可能的原因太多了。
最好使用双酶切，减少自连接的机会，而且可以确定连接的顺序正确。
赞一下 回复此楼
2楼2014-07-08 16:25:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seven拂晓

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:24
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-09 08:48:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以私信我，我可以教你如何弄！
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-09 11:13:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王宝明WANG

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:43
引用回帖:
4楼: Originally posted by 393658000 at 2014-07-09 11:13:21
可以私信我，我可以教你如何弄！

我的外源片段是8000bp（CLA1，PAC1双切）想与腺病毒骨架（28000bp)连接，小弟目前已经连接一年之久，但就是连接不上，每次转化长的斑很少，最多时也不超过30个。麻烦大神们帮帮，谢谢了。
目前我想到的方法有：1、换了商用化的DH5感受态 2、换了不同的腺病毒载体 3、换了不同的连接酶 4、摸过不同的连接比例
我认为可能有点问题：1、我的酶切产物都是一直放在四度 ，有可能有部分降解。
赞一下 回复此楼
5楼2014-07-09 15:30:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-07-09 08:48:17
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
赞一下 回复此楼
6楼2014-07-09 20:11:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 393658000 at 2014-07-09 11:13:21
可以私信我，我可以教你如何弄！

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
赞一下 回复此楼
7楼2014-07-09 20:11:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-07-09 08:48:17
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
赞一下 回复此楼
8楼2014-07-09 20:11:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-08 16:25:35
具体步骤怎样啊？可能的原因太多了。
最好使用双酶切，减少自连接的机会，而且可以确定连接的顺序正确。

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
赞一下 回复此楼
9楼2014-07-09 20:13:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jamesfeng

铁虫 (初入文坛)
★ ★
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:59
综合楼主信息可以得出，应该是片段连接到载体上的效率太低，转化的都是空载体质粒，有条件的话，重新设计引物，基因片段通过T5，与切好的线性载体连接。
赞一下 回复此楼
10楼2014-07-09 20:51:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhaoxiaopang 的主题更新
241/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料考研调剂 +27 云木达达 2026-04-11 29/1450 2026-04-12 22:48 by kyle12138
[考研] 22408 352分求调剂 +5 努力的夏末 2026-04-09 5/250 2026-04-12 19:17 by wj165256
[考研] 药学求调剂 +3 RussHu 2026-04-12 4/200 2026-04-12 17:49 by 陈皮皮
[考研] 求调剂，262机械专硕 +8 嗯yyl 2026-04-08 8/400 2026-04-12 02:31 by 秋豆菜芽
[考研] 290求调剂 +13 luoziheng 2026-04-10 13/650 2026-04-11 23:15 by labixiaoqiao
[考研] 331求调剂 +5 王国帅 2026-04-11 5/250 2026-04-11 22:56 by 溪涧流水
[考研] 化学308分求调剂 +22 你好明天你好 2026-04-07 24/1200 2026-04-11 11:14 by ChemPharm
[考研] 300分求调剂 （085501机械专硕，本科扬大） +8 xu@841019 2026-04-11 8/400 2026-04-11 10:46 by qingpingzhu
[考研] 085404 293求调剂 +9 勇远库爱314 2026-04-06 10/500 2026-04-11 10:36 by 紫曦紫棋
[考研] 农业管理302分求调剂 +3 xuening1 2026-04-10 3/150 2026-04-11 10:18 by zhq0425
[考研] 298求调剂 +9 钉叮咚冬瓜 2026-04-07 11/550 2026-04-11 09:35 by zhq0425
[考研] 22408调剂求助 +7 毂12 2026-04-09 9/450 2026-04-11 09:23 by 哦哦123
[考研] 一志愿京区985，085401，与本科专业一致，电子信息工程， +4 阳光开朗的男孩 2026-04-10 4/200 2026-04-10 18:27 by shenrf
[考研] 一志愿西交机械专硕求调剂 +8 求上岸的小王 2026-04-10 8/400 2026-04-10 15:09 by hemengdong
[考研] 337求调剂 +4 Gky09300550， 2026-04-09 4/200 2026-04-09 17:18 by 帕尔马拉特
[考研] 一志愿鲁东大学071000生物学学硕初试分数276求调剂 +3 慕绝cc 2026-04-09 3/150 2026-04-09 09:57 by liuhuiying09
[考研] 328求调剂 +17 lftmya 2026-04-07 18/900 2026-04-09 08:05 by 5268321
[考研] 电子信息346 +4 zuoshaodian 2026-04-08 4/200 2026-04-08 11:54 by zzucheup
[考研] 22408 调剂材料 +7 我叫ez 2026-04-06 8/400 2026-04-07 17:12 by 蓝云思雨
[考研] 312求调剂 +4 LR6 2026-04-06 4/200 2026-04-07 08:42 by jp9609
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭