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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶切连接连不上，要死了
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接连不上，要死了 已有10人参与

如题，最近构建质粒，载体是pIMP，使用的是单酶切位点Nde1.然后用一步克隆的方法做连接转化，感受态是DH5&，做了四五次都是连不上，长出来的单菌落做PCR结果目的条带都P不出来，不知道是什么原因。换了新的一步克隆试剂盒做对比依然还是连不上，求大神分析分析啊。。。。。。
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1楼 2014-07-08 15:37:24
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-08 18:14:47
具体步骤怎样啊？可能的原因太多了。
最好使用双酶切，减少自连接的机会，而且可以确定连接的顺序正确。
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2楼2014-07-08 16:25:35
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:24
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。
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3楼2014-07-09 08:48:17
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以私信我，我可以教你如何弄！
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4楼2014-07-09 11:13:21
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王宝明WANG

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:43
引用回帖:
4楼: Originally posted by 393658000 at 2014-07-09 11:13:21
可以私信我，我可以教你如何弄！

我的外源片段是8000bp（CLA1，PAC1双切）想与腺病毒骨架（28000bp)连接，小弟目前已经连接一年之久，但就是连接不上，每次转化长的斑很少，最多时也不超过30个。麻烦大神们帮帮，谢谢了。
目前我想到的方法有：1、换了商用化的DH5感受态 2、换了不同的腺病毒载体 3、换了不同的连接酶 4、摸过不同的连接比例
我认为可能有点问题：1、我的酶切产物都是一直放在四度 ，有可能有部分降解。
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5楼2014-07-09 15:30:24
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-07-09 08:48:17
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
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6楼2014-07-09 20:11:02
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 393658000 at 2014-07-09 11:13:21
可以私信我，我可以教你如何弄！

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
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7楼2014-07-09 20:11:43
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-07-09 08:48:17
有好多原因呢 不如详细说说你的实验过程
我前两天构建质粒也是遇到了问题，现在找到原因了 是因为酶切时间太长了（说明书上写着过夜不会出现星号活性，我切4个小时就不行了）。

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
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8楼2014-07-09 20:11:53
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zhaoxiaopang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-08 16:25:35
具体步骤怎样啊？可能的原因太多了。
最好使用双酶切，减少自连接的机会，而且可以确定连接的顺序正确。

载体单酶切37度过夜，胶回收。片段P出来也是单一条带再胶回收。然后就在连接体系是20UL，用的是一步克隆的试剂盒，连接半小时直接做转化。复苏后涂平板200Ul. 过夜长出来是满满一平板，挑单菌落做菌落PCR什么都P不出来。
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9楼2014-07-09 20:13:40
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jamesfeng

铁虫 (初入文坛)
★ ★
zhaoxiaopang(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-11 11:09:59
综合楼主信息可以得出，应该是片段连接到载体上的效率太低，转化的都是空载体质粒，有条件的话，重新设计引物，基因片段通过T5，与切好的线性载体连接。
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10楼2014-07-09 20:51:08
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