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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 【酶连】三片段连接总是做不出来，求助！
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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)

[求助] 【酶连】三片段连接总是做不出来，求助！已有3人参与

目前我手头有三个待连接的片段

片段1：含抗性基因和ori的载体骨架 ~4kb  BamHI SpeI酶切
片段2：目标基因1 ~4kb   SpeI SalI 酶切
片段3：目标基因2 ~0.7kb  BamHI XbaI酶切

片段1，2，3按1：1：5的比例用T4 ligase 4度过夜酶联后转化，板上没有长出阳性克隆，或者出现假阳性，做了几次都没做出来

请问各位有那里可以改进的呢？
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1楼2014-03-05 08:43:54
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
三片段连接没做过，不过建议一段一段的连接。可以用中间载体。坐等大神解答。
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2楼2014-03-05 09:11:22
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
哪个比例不知道怎么算的？
还有，T4不是16度过夜吗？
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3楼2014-03-05 09:12:16
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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-05 09:12:16
哪个比例不知道怎么算的？
还有，T4不是16度过夜吗？

摩尔比1：1：5   先测浓度，再根据大小算摩尔浓度

4度过夜或16度1小时，都OK吧
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4楼2014-03-05 09:26:12
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liu208xj

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切后，跑胶回收后再做连接
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5楼2014-03-05 09:56:52
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yugari_nagi

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liu208xj at 2014-03-05 09:56:52
酶切后，跑胶回收后再做连接

片段都是切胶回收的
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6楼2014-03-05 10:05:15
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yugari_nagi at 2014-03-05 09:26:12
摩尔比1：1：5   先测浓度，再根据大小算摩尔浓度

4度过夜或16度1小时，都OK吧...

我们实验室用的是全式金的，粘端连接：20-25度10min；平端连接：20-25度2h或16度过夜。
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7楼2014-03-05 10:56:45
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-05 14:48:36
酶切载体片段同时连接两个外源片段，理论上是没问题的，但实际上，还是分段连接可行性大。
此外，如果片段多，也可以采用例如CPEC或gibson组装方法实现无缝多片段组装
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8楼2014-03-05 12:19:25
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