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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 平末端连接不上，求助
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蓝慧

木虫 (正式写手)

[求助] 平末端连接不上，求助

大家好，本人最近在做平末端连接，我的PCR产物是混合引物PCR结果，用的是东洋纺的KOD-PLUS-NEO酶，PCR产物用OMEGA胶回收试剂盒进行回收，30微升体积稀释，回收后电泳检测有特异单一条带，浓度大约为150ng/ul，目的片段大小约为1500bp。接着进行连接，用的载体是全式金pEASY-blunt zero clonig KIT,连接体系5微升，包括2微升PCR产物，1微升载体，25度15min,之后50微升感受态转化，涂板，过夜培养，其中培养基为LB。培养后挑选白色菌落摇菌4小时M13引物菌液检测，可是PCR检测只有在100以下有个带，完全没有目的带，已经做了3次都是如此。现在都不知道是什么问题，请求各位虫子指点迷津，不胜感激！
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1楼 2012-12-19 10:34:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-19 15:54:41
PCR检测只有小于100的带是引物二聚体吧。你做PCR有做阳性对照吗？确定PCR条件合适？
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2楼2012-12-19 12:10:01
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-19 13:10:01
PCR检测只有小于100的带是引物二聚体吧。你做PCR有做阳性对照吗？确定PCR条件合适？

我用的是M13的通用引物，但是没有做过阳性对照，请教如何设计阳性对照？
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3楼2012-12-19 12:32:31
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望海思月

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-19 19:32:16
你的连接体系不对吧？平端连接，载体一点点就够了，片段要加大浓度
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4楼2012-12-19 16:26:47
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1 2012-12-19 19:32:25
具体说说你怎么PCR检测的呗？模板太多了不容易扩增。你可以把质粒快抽跑电泳，从大小就能看出来。
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5楼2012-12-19 17:19:46
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-19 18:19:46
具体说说你怎么PCR检测的呗？模板太多了不容易扩增。你可以把质粒快抽跑电泳，从大小就能看出来。

PCR检测是选白斑液体LB/AMP培养基摇4个小时，以1微升为模板，用rTaq PCR mix，M13F/M13R进行PCR，10微升体系，退火55度，30个循环。质粒快抽是跑电泳那是不是挑白斑就直接用2ml液体培养基培养直接抽提质粒？如何操作呢？
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6楼2012-12-19 19:09:13
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 望海思月 at 2012-12-19 17:26:47
你的连接体系不对吧？平端连接，载体一点点就够了，片段要加大浓度

载体是1微升，载体说明书上说是体积最好不超过5微升，片段浓度是150ng/ul左右，2微升。说明书建议是30ng就可以了，但经咨询试剂技术部，他说用2微升，然后自己也做了梯度，丛1微升到4微升，2微升是长的斑最好
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7楼2012-12-19 19:32:05
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2012-12-20 10:12:17
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-12-19 19:09:13
PCR检测是选白斑液体LB/AMP培养基摇4个小时，以1微升为模板，用rTaq PCR mix，M13F/M13R进行PCR，10微升体系，退火55度，30个循环。质粒快抽是跑电泳那是不是挑白斑就直接用2ml液体培养基培养直接抽提质粒？如何操 ...

我们都是菌落PCR，不会把培养基直接加到PCR体系中。质粒快抽也是用的固体平板上的菌苔或者离去上清的菌体，然后加各种溶液，跑电泳比较大小。
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8楼2012-12-19 20:41:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-12-19 12:32:31
我用的是M13的通用引物，但是没有做过阳性对照，请教如何设计阳性对照？...

阳性对照就是用随便什么pUC18/19载体上插入过已知片段的质粒。经常做克隆的，总有这样的质粒吧。
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9楼2012-12-20 08:50:35
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-20 09:50:35
阳性对照就是用随便什么pUC18/19载体上插入过已知片段的质粒。经常做克隆的，总有这样的质粒吧。...

有，谢谢！
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10楼2012-12-20 09:01:23
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