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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切位点不同，构建载体
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)

[求助] 酶切位点不同，构建载体

最近构建一个载体，由于载体和片段酶切位点不同，对载体和片段进行了平末端处理，然后进行平末端连接，始终连接不上，请问大家有什么建议，对于构建酶切位点不同的载体？不甚感激！
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1楼2012-08-04 21:49:09
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-05 22:05:51
你的实验中是双酶切还是单酶切？
如果你能给出更详细的信息（比如酶切位点等），大家可能更容易给你一些建议。
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鱼卡潘
2楼2012-08-04 22:15:59
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mydoves

木虫 (小有名气)
可以把片段里与载体相同的酶切位点突变掉，再连接比较好。
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鱼卡潘
3楼2012-08-05 15:49:06
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-08-04 22:15:59
你的实验中是双酶切还是单酶切？
如果你能给出更详细的信息（比如酶切位点等），大家可能更容易给你一些建议。

其中载体是per8，单酶切（xholⅠ），片端是双酶切（xbalⅠ, kpnⅠ）
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4楼2012-08-05 19:01:32
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by mydoves at 2012-08-05 15:49:06
可以把片段里与载体相同的酶切位点突变掉，再连接比较好。

你能解释的更清楚一些吗？怎么去突变，不甚感谢
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5楼2012-08-05 19:03:58
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
平末端连接，延长连接时间，连接体系中加入PEG4000，推荐使用fermentas的T4 ligase.
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6楼2012-08-05 22:09:30
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mydoves

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mydoves at 2012-08-05 15:49:06
可以把片段里与载体相同的酶切位点突变掉，再连接比较好。

就是设计引物两对引物，引物上包含要突变的位点，但不能改变原序列的氨基酸，通过2轮PCR就能得到突变后的序列。
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7楼2012-08-06 13:03:20
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-05 22:09:30
平末端连接，延长连接时间，连接体系中加入PEG4000，推荐使用fermentas的T4 ligase.

其实我一直在做这个平末端，但是使用takara（DNA Blunting Kit）试剂盒，平末端连接一直没有成功，不知道你什么建议。
之前就是对载体和片段分别酶切和割胶回收，对回收产物（浓度很低)使用该试剂盒，但是一直没有成功。
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8楼2012-08-06 13:36:52
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mydoves at 2012-08-06 13:03:20
就是设计引物两对引物，引物上包含要突变的位点，但不能改变原序列的氨基酸，通过2轮PCR就能得到突变后的序列。...

很感谢，但这个我没有做过，我再查查。
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9楼2012-08-06 13:37:59
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 鱼卡潘 at 2012-08-06 13:36:52
其实我一直在做这个平末端，但是使用takara（DNA Blunting Kit）试剂盒，平末端连接一直没有成功，不知道你什么建议。
之前就是对载体和片段分别酶切和割胶回收，对回收产物（浓度很低)使用该试剂盒，但是一直没有 ...

我没有做过粘性末端抹平，更没有使用过这个试剂盒，这一步不太清楚。但得到平末端之后，以我的经验，不能用takara的T4 ligase,几乎是连不上的。用fermentas的，加入PEG4000，还是比较容易连接的。
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10楼2012-08-06 18:30:08
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