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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)

[求助] 酶切位点不同,构建载体

最近构建一个载体,由于载体和片段酶切位点不同,对载体和片段进行了平末端处理,然后进行平末端连接,始终连接不上,请问大家有什么建议,对于构建酶切位点不同的载体?不甚感激!
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-05 22:05:51
你的实验中是双酶切还是单酶切?
如果你能给出更详细的信息(比如酶切位点等),大家可能更容易给你一些建议。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2012-08-04 22:15:59
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mydoves

木虫 (小有名气)

可以把片段里与载体相同的酶切位点突变掉,再连接比较好。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2012-08-05 15:49:06
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2012-08-04 22:15:59
你的实验中是双酶切还是单酶切?
如果你能给出更详细的信息(比如酶切位点等),大家可能更容易给你一些建议。

其中载体是per8,单酶切(xholⅠ),片端是双酶切(xbalⅠ, kpnⅠ)
4楼2012-08-05 19:01:32
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by mydoves at 2012-08-05 15:49:06
可以把片段里与载体相同的酶切位点突变掉,再连接比较好。

你能解释的更清楚一些吗?怎么去突变,不甚感谢
5楼2012-08-05 19:03:58
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
平末端连接,延长连接时间,连接体系中加入PEG4000,推荐使用fermentas的T4 ligase.
6楼2012-08-05 22:09:30
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mydoves

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by mydoves at 2012-08-05 15:49:06
可以把片段里与载体相同的酶切位点突变掉,再连接比较好。

就是设计引物两对引物,引物上包含要突变的位点,但不能改变原序列的氨基酸,通过2轮PCR就能得到突变后的序列。
7楼2012-08-06 13:03:20
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-05 22:09:30
平末端连接,延长连接时间,连接体系中加入PEG4000,推荐使用fermentas的T4 ligase.

其实我一直在做这个平末端,但是使用takara(DNA Blunting Kit)试剂盒,平末端连接一直没有成功,不知道你什么建议。
之前就是对载体和片段分别酶切和割胶回收,对回收产物(浓度很低)使用该试剂盒,但是一直没有成功。
8楼2012-08-06 13:36:52
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鱼卡潘

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by mydoves at 2012-08-06 13:03:20
就是设计引物两对引物,引物上包含要突变的位点,但不能改变原序列的氨基酸,通过2轮PCR就能得到突变后的序列。...

很感谢,但这个我没有做过,我再查查。
9楼2012-08-06 13:37:59
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 鱼卡潘 at 2012-08-06 13:36:52
其实我一直在做这个平末端,但是使用takara(DNA Blunting Kit)试剂盒,平末端连接一直没有成功,不知道你什么建议。
之前就是对载体和片段分别酶切和割胶回收,对回收产物(浓度很低)使用该试剂盒,但是一直没有 ...

我没有做过粘性末端抹平,更没有使用过这个试剂盒,这一步不太清楚。但得到平末端之后,以我的经验,不能用takara的T4 ligase,几乎是连不上的。用fermentas的,加入PEG4000,还是比较容易连接的。
10楼2012-08-06 18:30:08
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