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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物连接请教！
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hnndpt

铁虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物连接请教！ 已有5人参与

PCR扩增后需要连接到载体上去测序，对原理不太明白，请教大家：
1.PCR产物是两端带一个A碱基的粘性末端，T载体两端带个T的粘性末端，直接用连接酶连接就OK了，请问原理是这样的吗？
2.载体是不是先用什么酶切开之后再连接？克隆后去测序的载体是不是都是这样的？（带T的粘性末端？）
3.克隆载体是否全是T载体？ 请各位帮忙解疑！
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1楼 2010-10-20 14:30:16
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
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TA 连接

有专门连接高保真的平末端载体，例如fermantas
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2楼2010-10-20 14:55:00
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46437772

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-10-20 15:57:18
1.PCR产物不一定都是A碱基末端，有一些扩增酶的PCR产物是平端的，事先请搞清。
2.如果载体酶切之后再连接的话，那么PCR产物的两个末端应该事先设计上相应酶切位点，扩增的得到目的片段后用相应的酶切后与载体连接。
3.克隆载体有很多种，可根据具体需要选择。
4.PCR产物经电泳验证为单一目的条带后，可直接送公司测序。

[ Last edited by 46437772 on 2010-10-20 at 16:42 ]
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3楼2010-10-20 15:28:36
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wyzl2007

金虫 (小有名气)
★
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如果你单单是为了测序，就不需要这么麻烦了，PCR产物直接交给测序公司即可
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4楼2010-10-20 16:18:15
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fjt198719

木虫 (著名写手)

永远的菜鸟
★
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PCR产物可以直接送去测序，连接T载体后测序的目的是：PCR产物直接3‘和5’端会有几十或上百bp测不准确，T载体测序可以完全测正确。
另外如楼上所说的不一定每个taq酶扩出来都带A碱基，高保真的酶一般扩的产物末端都不带A的。
T载体不同酶切直接用的。
也可以直接用自己的目的载体来酶切酶连构建
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独YY不如众YY！！！
5楼2010-10-20 16:51:37
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hnndpt

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fjt198719 at 2010-10-20 16:51:37:
PCR产物可以直接送去测序，连接T载体后测序的目的是：PCR产物直接3‘和5’端会有几十或上百bp测不准确，T载体测序可以完全测正确。
另外如楼上所说的不一定每个taq酶扩出来都带A碱基，高保真的酶一般扩的产物末端 ...

很专业！谢谢！
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6楼2010-10-21 08:37:26
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