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hnndpt

铁虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物连接请教! 已有5人参与

PCR扩增后需要连接到载体上去测序,对原理不太明白,请教大家:
1.PCR产物是两端带一个A碱基的粘性末端,T载体两端带个T的粘性末端,直接用连接酶连接就OK了,请问原理是这样的吗?
2.载体是不是先用什么酶切开之后再连接?克隆后去测序的载体是不是都是这样的?(带T的粘性末端?)
3.克隆载体是否全是T载体? 请各位帮忙解疑!
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wyzl2007

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果你单单是为了测序,就不需要这么麻烦了,PCR产物直接交给测序公司即可
4楼2010-10-20 16:18:15
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taigongzaici

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
TA 连接

有专门连接高保真的平末端载体,例如fermantas
2楼2010-10-20 14:55:00
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46437772

木虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):鼓励交流 2010-10-20 15:57:18
1.PCR产物不一定都是A碱基末端,有一些扩增酶的PCR产物是平端的,事先请搞清。
2.如果载体酶切之后再连接的话,那么PCR产物的两个末端应该事先设计上相应酶切位点,扩增的得到目的片段后用相应的酶切后与载体连接。
3.克隆载体有很多种,可根据具体需要选择。
4.PCR产物经电泳验证为单一目的条带后,可直接送公司测序。

[ Last edited by 46437772 on 2010-10-20 at 16:42 ]
3楼2010-10-20 15:28:36
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fjt198719

木虫 (著名写手)

永远的菜鸟


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
PCR产物可以直接送去测序,连接T载体后测序的目的是:PCR产物直接3‘和5’端会有几十或上百bp测不准确,T载体测序可以完全测正确。
另外如楼上所说的不一定每个taq酶扩出来都带A碱基,高保真的酶一般扩的产物末端都不带A的。
T载体不同酶切直接用的。
也可以直接用自己的目的载体来酶切酶连构建
独YY不如众YY!!!
5楼2010-10-20 16:51:37
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