24小时热门版块排行榜    

查看: 2064  |  回复: 7

xulanzzz

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】重叠PCR的问题??? 已有1人参与

大家好,这个是重叠PCR的步骤:请问里面的第5)步的延伸都需要添加什么??
1)  以引物A/B进行PCR1;
2)  以引物C/D进行PCR2;
3)  引物B/C中引入了需要的限制性位点;
4)  混合二者PCR产物,混合以前最好回收一下;
5)  进行PCR延伸反应,1-5个循环即可。
6)  以延伸反应的产物为模板,以A/D为引物进行PCR;
7)  产物即为所需最终产物。

[ Last edited by xulanzzz on 2010-10-11 at 13:05 ]
回复此楼
DOBEST
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)

互为模板延伸,但是“只有右面”就不懂指哪个
2楼2010-10-11 10:50:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hongchenlyan

金虫 (小有名气)

我曾经做过,是删除一段序列,设计B/C引物基本一致,跨所要删的序列,1)2)步骤一致,然后分别回收产物,大致等量混合后,以A/D为引物进行PCR获得终产物。
3楼2010-10-11 11:12:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xulanzzz

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-10-11 10:50:31:
互为模板延伸,但是“只有右面”就不懂指哪个

这个本来下面有一个图说明,但是图粘贴不上。请问延伸的反应要不要添加聚合酶?
DOBEST
4楼2010-10-11 11:50:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xulanzzz

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by hongchenlyan at 2010-10-11 11:12:48:
我曾经做过,是删除一段序列,设计B/C引物基本一致,跨所要删的序列,1)2)步骤一致,然后分别回收产物,大致等量混合后,以A/D为引物进行PCR获得终产物。

重叠PCR有两种做法,你说的是其中一种,即模板等量混合之后进行常规PCR,还有另一种是先进行5个循环的延伸,然后添加引物进行PCR。
DOBEST
5楼2010-10-11 11:57:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王会征

铁杆木虫 (著名写手)

把混好的体系放在PCR仪里,温度调到72度不就是延伸了啊。
6楼2010-10-11 12:05:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasco

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2010-10-11 11:50:36:

这个本来下面有一个图说明,但是图粘贴不上。请问延伸的反应要不要添加聚合酶?

加!
7楼2010-10-11 13:37:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sd3824289

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
taq酶要加的,要看你后面做什么了,如果精确度要求很高,建议使用高保真的Taq酶,这样结果又保证!做连接测序的时候T载体要选择平末端连接的载体!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
8楼2012-07-27 17:56:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xulanzzz 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤?
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +17 羊腰板 2026-08-21 19/950 2026-08-24 16:52 by iaeyuan
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 21/1050 2026-08-24 14:21 by refreshing11
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 让我中一个面上吧! +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 什么时候开奖? +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天放榜吗? +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 今天基金会出结果吗?20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 重要消息,中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
请填处理意见