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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】重叠PCR的问题???
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xulanzzz

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】重叠PCR的问题??? 已有1人参与

大家好，这个是重叠PCR的步骤：请问里面的第5）步的延伸都需要添加什么？？
1)  以引物A/B进行PCR1；
2)  以引物C/D进行PCR2；
3)  引物B/C中引入了需要的限制性位点；
4)  混合二者PCR产物，混合以前最好回收一下；
5)  进行PCR延伸反应，1-5个循环即可。
6)  以延伸反应的产物为模板，以A/D为引物进行PCR；
7)  产物即为所需最终产物。

[ Last edited by xulanzzz on 2010-10-11 at 13:05 ]
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DOBEST
1楼 2010-10-11 10:33:41
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jasco

木虫 (正式写手)
互为模板延伸，但是“只有右面”就不懂指哪个
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2楼2010-10-11 10:50:31
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hongchenlyan

金虫 (小有名气)
我曾经做过，是删除一段序列，设计B/C引物基本一致，跨所要删的序列，1）2）步骤一致，然后分别回收产物，大致等量混合后，以A/D为引物进行PCR获得终产物。
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3楼2010-10-11 11:12:48
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by jasco at 2010-10-11 10:50:31:
互为模板延伸，但是“只有右面”就不懂指哪个

这个本来下面有一个图说明，但是图粘贴不上。请问延伸的反应要不要添加聚合酶？
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DOBEST
4楼2010-10-11 11:50:36
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by hongchenlyan at 2010-10-11 11:12:48:
我曾经做过，是删除一段序列，设计B/C引物基本一致，跨所要删的序列，1）2）步骤一致，然后分别回收产物，大致等量混合后，以A/D为引物进行PCR获得终产物。

重叠PCR有两种做法，你说的是其中一种，即模板等量混合之后进行常规PCR，还有另一种是先进行5个循环的延伸，然后添加引物进行PCR。
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DOBEST
5楼2010-10-11 11:57:40
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
把混好的体系放在PCR仪里，温度调到72度不就是延伸了啊。
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6楼2010-10-11 12:05:02
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jasco

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2010-10-11 11:50:36:

这个本来下面有一个图说明，但是图粘贴不上。请问延伸的反应要不要添加聚合酶？

加！
7楼2010-10-11 13:37:43
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
taq酶要加的，要看你后面做什么了，如果精确度要求很高，建议使用高保真的Taq酶，这样结果又保证！做连接测序的时候T载体要选择平末端连接的载体！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
8楼2012-07-27 17:56:27
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